三疣梭子蟹Apaf-1基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達分析*

王 磊 任憲云 宋 柳 呂建建 高保全 劉 萍 孫東方

三疣梭子蟹基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達分析*

王 磊1,3任憲云2,3宋 柳1,3呂建建2,3高保全2,3劉 萍2,3①孫東方3

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島 266071)

本研究利用RACE方法克隆獲得三疣梭子蟹()凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apoptotic protease activating factor-1,基因，該基因cDNA全長為2032 bp，其中，ORF為1050 bp，編碼349個氨基酸，預測分子量為39.13 kDa，理論等電點為7.67。同源性和系統發育分析顯示，與凡納濱對蝦()的同源性最高，為51.27%，并與凡納濱對蝦聚為一支。組織表達分析顯示，基因的相對表達水平在肝胰臟最高，其次是肌肉、心臟、鰓和眼柄，血細胞和表皮最低。不同鹽度脅迫后，在Ⅱ期幼蟹體內表達水平在3 h達到最大值，此后，呈先下降再上升趨勢；在80日齡鹽度20脅迫后三疣梭子蟹的鰓中呈上升趨勢，在肝胰腺中為先上升后下降趨勢，表明鹽度改變能影響該基因在鰓和肝胰腺組織中的表達。不同病原感染實驗結果顯示，在血細胞中，注射副溶血弧菌()后的表達于48 h到達峰值，為對照組的2.76倍(<0.05)，注射白斑綜合征病毒(WSSV)后，僅在12 h表達水平上調，為對照組的1.25倍(<0.05)；在肝胰腺中，注射副溶血弧菌后在72 h到達峰值，為對照組的5.44倍(<0.05)，注射WSSV后在12 h到達峰值，為對照組的5.89倍(<0.05)，整體呈上調表達趨勢。本研究為進一步理解三疣梭子蟹基因的生理功能提供了參考。

三疣梭子蟹；；低鹽度脅迫；副溶血弧菌；WSSV

凋亡蛋白酶激活因子-1 (Apaf-1蛋白)是促進細胞凋亡發生的一個重要基因，Zou等(1997、1999)首次從子宮頸癌細胞(HeLa細胞)胞漿內純化和克隆出Apaf-1蛋白，已有報道證實，它在線粒體介導的凋亡過程中起核心作用(Campioni, 2005)。Apaf-1是發育性程序化細胞死亡的重要組成部分(Cecconi, 2001)，多種凋亡刺激干擾線粒體正常的電子轉移鏈過程，導致細胞色素c從線粒體向胞漿釋放，釋放的細胞色素c易與Apaf-1結合，引發Apaf-1蛋白構象改變，從而使其與dATP穩定結合，這一過程導致凋亡小體的形成，進一步促使了凋亡的發生。

三疣梭子蟹()主要分布于中國、朝鮮、日本等國家的沿海水域(戴愛云等, 1977)，是重要的海產經濟蟹類，在我國具有較大的養殖規模。鹽度和病原感染均能引起細胞凋亡的發生，鹽度是三疣梭子蟹生長發育的主要環境因子之一，在蛻皮、生長、代謝和免疫等生命活動過程中發揮重要作用(Cheng, 2000; Sang, 2004; Romano, 2006; 楊其彬等, 2008; 王沖等, 2010)。當外界水環境發生改變時，鰓是水生生物感受鹽度變化最為敏感的器官。魚類的鹽度適應是凋亡機制的觸發因素，尤其是在鰓的氯化物(或線粒體)細胞、皮膚和胃腸道的表皮成份中(Anvarifar, 2016)。Bonga等(1989)研究認為，無論是在淡水適應還是海水適應的樣品中，羅非魚()鰓纖維和板層上皮細胞的變性和死亡均主要是通過細胞凋亡發生。Iger等(1994)通過研究鯉魚()經海水浸泡處理后表皮細胞、鄰近細絲細胞和白細胞超微結構發現，隨著海水鹽分含量的增加，細胞凋亡的細絲細胞數量增加。韓曉琳等(2014)關于低鹽對三疣梭子蟹鰓和肝胰腺組織的顯微結構的研究表明，低鹽脅迫能分別對鰓和肝胰腺組織中的鰓上皮細胞和肝細胞造成損傷，從而間接影響細胞凋亡的發生。因此，無論是在魚類還是三疣梭子蟹中，細胞凋亡均是存在的，其在鹽度適應過程中普遍發生并發揮著不可替代的功能。甲殼動物病原感染是水產養殖中的一個嚴重問題，已在許多蝦類中進行了關于病原感染在細胞凋亡中的研究，但在三疣梭子蟹中還未見報道。通過消除病原感染的細胞，發現細胞凋亡在包括對蝦在內的許多生物的抗病原過程中也發揮重要作用(Granja, 2006; Kanokpan, 2003)。細胞凋亡除了在細胞發育和轉換過程中發揮重要作用外，在先天免疫中也具有關鍵作用(Everett, 1999)。免疫反應是由病原感染引起的，從病原的角度來看，入侵者必須避免宿主誘導的細胞凋亡(McLean, 2008; Irusta, 2003; Hilleman, 2004; Helen, 2002; Galluzzi, 2008)。甲殼類動物和其他無脊椎動物一樣依賴先天免疫，而不存在基于抗體的適應性免疫(Bayne, 2003)。Caspase介導的細胞凋亡是甲殼動物抗病毒免疫的重要機制(Lei, 2008; Wang, 2013)，甲殼動物凋亡進程的發生是通過直接抑制啟動子caspase上游的基因來控制的。為了探究在低鹽脅迫和病原感染后基因是否參與細胞凋亡，本研究以基因作為研究對象，分析該基因在低鹽脅迫和病原感染環境條件下的表達規律，為后續研究三疣梭子蟹凋亡途徑的調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗分別于2018年5月和8月在山東昌邑海豐水產養殖有限公司內進行，5月實驗所用個體為Ⅱ期幼蟹，隨機選取健康的Ⅱ期幼蟹置于大小規格相同的整理箱中，用于鹽度脅迫實驗，每天更換1/3海水，定時投喂大鹵蟲；8月實驗所用個體為80日齡蟹(通過顯微鏡下觀察三疣梭子蟹游泳足趾節末端結構，選取處在蛻皮間期的梭子蟹)，體重為(32.0±0.8) g，于室內水泥池中暫養7 d用于后續的鹽度脅迫和病原感染實驗，暫養期間，水溫為(24±2)℃，鹽度為33，連續充氧，每天更換約1/3體積海水，定時投喂新鮮雜魚。

1.2 三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA全長的克隆

根據本實驗室構建的三疣梭子蟹轉錄組數據庫，篩選得到基因的序列，用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計3′和5′特異性RACE引物(表1)、長短鏈UPM、NUP通用引物進行RACE克隆，本實驗使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。利用TaKaRa LA?試劑盒進行3′和5′末端全長序列片段擴增。3′末端擴增以AP-F1和通用引物UPM混合進行第1次PCR；然后以第1次反應產物為模板，以AP-F2和通用引物NUP混合進行第2次PCR。5′末端擴增以AP-R1和通用引物UPM配對進行第1次擴增；然后以第1次反應產物為模板，以AP-R2和通用引物NUP配對進行第2次擴增。PCR程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57.0℃ 30 s，70℃ 1 min，共35個循環；70℃ 10 min。將獲得的PCR產物切膠回收、載體連接、轉化進入感受態細胞中，挑取并利用通用引物進行菌落PCR，對陽性單克隆菌落進行鑒定，篩選目的菌液測序。

1.3 Apaf-1基因的生物信息學分析

利用Contig Express軟件對測序得到的3′序列、5′序列與驗證的基因EST序列進行拼接，得到基因的cDNA全長；使用國家生物技術信息中心(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)提供的ORF查找器識別得到開放閱讀框架(ORF)，并對編碼的氨基酸進行翻譯；用BLAST軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)檢測核苷酸序列相似性，ExPASy (http://web.expasy. org/computepi/)在線軟件進行分子量及等電點的預測；通過Pfam (http://pfam.xfam.org/search)數據庫進行蛋白質功能結構域分析；以氨基酸序列為基礎，采用近鄰連接法，利用分子進化遺傳學分析MEGA 6.0，建立基于氨基酸序列的系統發育樹來比較分析各物種之間的親緣關系。

1.4 低鹽脅迫實驗

1.4.1 Ⅱ期幼蟹鹽度脅迫實驗 取1200只健康活潑的Ⅱ期幼蟹，平均分成4組，包括1個對照組，為鹽度35的自然海水，3個低鹽度脅迫實驗組，鹽度分別為30、25、20，低鹽水體調配方法詳見隋延明等(2012)。鹽度脅迫實驗在完全一致的整理箱中進行，實驗設置3個平行。鹽度脅迫后，分別在0、3、6、12、24、48和72 h時進行取樣。由于Ⅱ期幼蟹個體比較小，每個時間點取10只進行混合，置于凍存管中，樣品置于液氮中保存。

1.4.2 80日齡三疣梭子蟹鹽度脅迫實驗 隨機選取30只暫養后健康的三疣梭子蟹進行72 h半致死鹽度(72h-LC50)預實驗(韓曉琳等, 2014; 隋延鳴, 2012)，確定72h-LC50為11。根據隋延明等(2012)的方法進行鹽度脅迫預實驗，得出本實驗80日齡梭子蟹72 h半致死的鹽度為11。正式實驗前，連續充氣暫養7 d，每天定時換水投喂餌料。正式實驗時，設置鹽度33的對照組、低鹽20實驗組和低鹽11實驗組。低鹽水體的調配方法見隋延明等(2012)，實驗期間的飼養管理與暫養期保持一致，每個實驗組90只蟹子，設置3個平行。各鹽度實驗組取樣時間與Ⅱ期幼蟹相同。各時間點隨機取3只梭子蟹，并取3個平行樣品的鰓組織和肝胰腺組織樣本，標記編號后置于液氮保存。

1.5 病原感染實驗

取暫養后健康活潑的80日齡三疣梭子蟹300只，均分為3組，每組100只，均于游泳足第一關節基膜處(謝建軍等, 2011; Ren, 2017)進行注射，空白對照組注射100 μl無菌的海洋甲殼動物生理鹽水，副溶血弧菌()實驗組和WSSV實驗組注射濃度參照張杰等(2018)的72 h半致死濃度，預實驗得到副溶血弧菌和白斑綜合征病毒(WSSV)分別為2.5×107CFU/ml、3.4×107拷貝/ml，并在此基礎上進行感染實驗，其中，WSSV粗提液和副溶血弧菌懸液參照竇全偉等(2019)的方法提取制備，實驗設3個平行，實驗過程中，飼養管理與暫養期一致。在注射病原后的0、3、6、12、24、48和72 h取梭子蟹的血細胞和肝胰腺組織樣本，每個時間點隨機取3只梭子蟹進行混合處理，每只都于游泳足第1關節基膜處或心臟處抽取1 ml血液，并與1 ml抗凝劑均勻混合，轉移置l.5 ml無RNA酶離心管中，4℃ 4000 r/min離心15 min，然后將上清液即血清去掉，保留血細胞，用于后續實驗，該實驗設3個平行，樣品標記編號后置于液氮中保存。

1.6 三疣梭子蟹Apaf-1基因的表達分析

采用TRIzol (Roche公司)方法提取總RNA，選取高質量的RNA進行實時熒光PCR定量分析檢測，參照PrimeScriptRTreagent Kit說明書反轉錄合成20 μl cDNA，用于后續實驗。定量的引物設計基于所獲得的基因的cDNA全長序列(表1)，內參基因選用β-actin(表1)，樣品的熒光定量分析通過使用Applied BiosystemsTM7500 Real Time PCR instrument定量儀，采用2-ΔΔCt的計算方法進行。實時PCR反應體系為10 μl，其中，SYBR Premix ExTMⅡ 5 μl、cDNA 1 μl、10 pmol/μl正反引物各0.4 μl、ROX Reference dye Ⅱ 0.2 μl和去離子水3 μl。反應程序: 95℃ 10 min; 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 34 s, 40個循環; 95℃ 15 s; 60℃ 1 min; 95℃ 15 s。反應完成后，采用Excel (Somboonna, 2010)進行統計，并用2-ΔΔCt來比較值法計算數據，利用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析，<0.05表示差異顯著。

表1 本實驗所用引物序列

Tab.1 Sequences of the primers used in this study

2 結果與分析

2.1 Apaf-1基因的cDNA全長及序列同源性分析

實驗獲得的三疣梭子蟹基因(GenBank登錄號MH178242)的結構特征見圖1。由圖1可以看出，該基因的cDNA序列全長為2032 bp，其中，ORF為1050 bp，共編碼349個氨基酸，預測理論等電點為7.67，分子量為39.13 kDa，且不穩定系數為45.84，推測為不穩定蛋白質。SMART預測該基因存在Ⅱ類醛縮酶和內收蛋白N端結構域(圖1)。利用Blast在線軟件來比較三疣梭子蟹和其他物種的Apaf-1氨基酸序列(圖2)，結果顯示，三疣梭子蟹基因與凡納濱對蝦的同源性最高為51.27%。使用MEGA 6.0軟件對三疣梭子蟹基因系統進化分析(圖3)，結果顯示，與凡納濱對蝦聚為一支，在進化上關系較近，而與脊椎動物等親緣關系較遠。

2.2 Apaf-1基因組織表達分析

基因組織分布情況如圖4所示，各組織中均有該基因表達，其中，在肝胰腺中表達量最高，然后是肌肉、心臟、鰓和眼柄和血細胞，表皮中表達量最低。

圖1 三疣梭子蟹Apaf-1基因cDNA全長及其編碼的氨基酸序列

ATG：起始密碼子；*：終止密碼子；下劃線區域為基因Ⅱ類醛縮酶和內收蛋白N-末端結構域

ATG: Start codon; *: Stop codon; Bold underlines indicate Class II Aldolase and Adducin N-terminal domain

圖2 三疣梭子蟹Apaf-1氨基酸序列比對

圖3 基于Apaf-1氨基酸序列的不同物種進化樹分析

圖4 三疣梭子蟹Apaf-1基因在各組織中的表達

He：肝胰腺；M：肌肉；H：心臟；G：鰓；E：眼柄；Hem：血細胞；C：表皮柱上不同字母代表差異顯著(<0.05)，下同

He: Hepatopancreas; M: Muscle; H: Heart; G: Gill; E: Eyestalk; Hem: Hemocyte; C: Cutex Different letters indicate significant difference (<0.05). The same as below

2.3 三疣梭子蟹低鹽脅迫下Apaf-1基因的表達分析

2.3.1 三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹鹽度脅迫下的表達分 析 三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹在低鹽脅迫后基因表達情況如圖5所示。不同鹽度脅迫后，基因的表達發生明顯變化，在鹽度30、25、20脅迫后，該基因的表達水平均于3 h達到峰值，分別為對照組的6.7倍、23.9倍和5.6倍，均為上調表達(<0.05)。

2.3.2 三疣梭子蟹80日齡個體低鹽脅迫后的表達分析 三疣梭子蟹在鹽度脅迫后的鰓和肝胰腺組織中的基因表達情況如圖6所示。在鰓組織中，鹽度20脅迫后，基因表達量整體呈先上升后下降再上升的趨勢，與對照組相比，除3 h、48 h兩個時間點之外，其余時間點該基因均為上調表達(<0.05)，72 h基因表達量最高，為對照組的

圖5 低鹽脅迫下Ⅱ期幼蟹的表達水平

圖6 三疣梭子蟹Apaf-1基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達

6.67倍。在鹽度11脅迫后，基因表達量呈先下降后上升再下降的趨勢，與對照組相比，從3 h起，該基因的表達量均出現顯著下調(<0.05)，且在3 h該基因表達量下調至最低值，為對照組的0.04倍，在24 h表達量有所回升，為正常對照組的0.59倍(<0.05)。在肝胰腺組織中，在鹽度20脅迫下，在3 h該基因表達量最少，是對照組的0.55倍(<0.05)，此后，表達量上升至72 h，整體均為上調表達，其中，12 h到達最大值，為對照組的5.11倍(<0.05)。在鹽度11脅迫下，基因表達量在24 h降至最低值，為對照組的0.07倍(<0.05)，除12 h、72 h外，整體均呈下調表達(<0.05)。

2.3.3 三疣梭子蟹80日齡個體病原感染后的表達分析基因病原感染在三疣梭子蟹血細胞和肝胰腺組織中表達情況如圖7所示。注射副溶血弧菌后，在血細胞中，基因表達呈先下降后上升再下降的趨勢，在48 h到達峰值，為生理鹽水對照組的2.76倍(<0.05)，WSSV注射后，基因僅在12 h血細胞中出現上調，表達水平為生理鹽水對照組的1.25倍(<0.05)，其余時間為下調表達。在肝胰腺中，注射副溶血弧菌后，基因表達呈先上升后下降再上升的趨勢，在72 h到達峰值，為生理鹽水對照組的5.44倍(<0.05)，在感染WSSV后，基因表達量呈先上升后下降的趨勢，在12 h到達峰值，為對照組的5.89倍(<0.05)，在72 h恢復到對照組的正常水平，整體表達水平均呈顯著上調。

圖7 三疣梭子蟹血細胞和肝胰腺感染副溶血弧菌和 WSSV病毒后Apaf-1基因的表達

3 討論

本研究首次克隆獲得三疣梭子蟹凋亡蛋白酶激活因子-1基因全長，將其命名為，cDNA全長為2032 bp，其中，開放閱讀框1050 bp，編碼1個由349個氨基酸所組成的多肽。基因編碼的蛋白質經Blast在線比對顯示，與其他無脊椎動物以及脊椎動物的同源性都較高(73%~98%)。系統進化樹得出，三疣梭子蟹與凡納濱對蝦聚為一支，與其他無脊椎動物聚為一類。同源性分析表明，基因編碼的氨基酸與其他物種的基因編碼的氨基酸一樣高度保守，具有特定的內收蛋白N端結構域。綜上所述，可以確定該序列為三疣梭子蟹基因序列。

根據組織表達分布，得出該基因在肝胰腺中表達量最高，推測肝胰腺是其基因發生作用的主要場所。鹽度脅迫后，Ⅱ期幼蟹中基因的表達量在3 h時到達峰值，可能由于鹽度驟變Ⅱ期幼蟹對鹽度的響應性較強，王沖等(2010)研究表明，鹽度驟變20或以上時，顯著影響三疣梭子蟹Ⅱ期幼蟹的存活率，當幼蟹適應鹽度變化后，基因的表達量就會隨著時間的推移而慢慢上升。80日齡在鹽度20脅迫后，該基因在鰓中的表達量增加，Kammerer等(2009)研究認為，鹽度脅迫下羅非魚鰓組織的鰓上皮的凋亡細胞隨時間的延長而增加。在鹽度11時，該基因的表達量低于對照組水平，推測可能由于鹽度脅迫導致機體生命活動紊亂，鰓的組織結構發生變化，從而導致該基因表達量降低。肝胰腺中基因的表達量在鹽度20和11時均呈先上升后下降的趨勢，不同之處在于前者整體呈上調表達，后者為下調表達。根據韓曉琳等(2014)低鹽脅迫后三疣梭子蟹的肝胰腺的顯微鏡結構，低鹽脅迫后肝胰腺組織中的肝細胞形態發生的變化，反映了凋亡活化因子的對應表達。表明低鹽脅迫通過影響基因的表達，從而促進細胞凋亡的進程。

甲殼動物的免疫系統中血細胞和肝胰腺具有清除受損細胞的作用(Yao, 2006)。凋亡基因在病原體入侵過程中的可能作用是參與機體清除受損細胞過程，在病原脅迫實驗中，甲殼類血細胞主要參與對外來物質的識別和清除，其免疫應答多發生在感染后的前12 h (S?derh?ll, 1998)，感染副溶血弧菌后，基因在12 h表達量增加；感染WSSV后，該基因在24 h到達峰值，此過程中，該基因的表達量上升，清除對機體免疫產生的受損細胞，保持機體正常的生理活動?；蛟谧⑸涓比苎【蟮母我认僦械谋磉_量呈先升高后降低再升高的趨勢，病原脅迫后，機體細胞會產生免疫反應，來主動防御外來物質的入侵，此時的表達量會上升，幫助機體清除受損細胞，來保護機體正常生理機能(Chang, 2008)?；蛟谌嗨笞有犯腥網SSV后的肝胰腺中出現顯著上調表達(<0.05)，在血細胞和肝胰腺中的表達不同，推測可能是由于在血細胞和肝胰腺中，二者的調控機制不同，受病原感染之后的凋亡機制也不一樣。病原感染實驗表明，基因參與了細胞凋亡的發生。

4 結論

本研究探討了三疣梭子蟹低鹽脅迫和病原感染后凋亡通路基因的表達模式及可能的調控機制，克隆了基因cDNA全長，分析了基因在主要組織中的表達情況，明確了在低鹽脅迫過程中，該基因在肝胰腺和鰓組織中的表達變化模式，初步了解基因在免疫防御的響應機理，為深入研究三疣梭子蟹凋亡通路在鹽度適應和病原感染中的作用機制提供了參考。

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Cloning and Expression Analysis of theGene inafter Exposure to Low Salt and Pathogenic Stresses

WANG Lei1,3, REN Xianyun2,3, SONG Liu1,3, Lü Jianjian2,3, GAO Baoquan2,3, LIU Ping2,3①, SUN Dongfang3

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071; 3. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071)

In this study, the apoptotic protein activator 1 (apoptotic protease activating factor-1,) gene of the swimming crab () was cloned using the RACE technique. The full length of the gene was 2032 bp, and the ORF was 1050 bp, encoding 349 amino acids, with a predicted molecular weight of 39.13 kDa, and a theoretical isoelectric point of 7.67. The homology and phylogenetic analysis showed that the homology ofwithwas 51.27%, and it was also clustered with. Tissue expression analysis showed that the relative expression level of thegene was highest in the hepatopancreas, followed by the muscle, heart, gill, and eyestalk, and was lowest in the hemocytes and epidermis. After different salinity stresses, the expression level ofin the stage Ⅱ juvenile crab reached its maximum at 3 h, and then decreased and then increased.showed an upward trend in the gills after salinity 20 stress after 80 d, and an upward and downward trend in the hepatopancreas, suggesting that the change of salinity could affect the expression ofin the gill and hepatopancreas. The results showed that the expression ofreached its peak at 48 h after injection of, which was 2.76 times higher than that of the control group (<0.05), and increased 12 h after the injection of white spot syndrome virus (WSSV), which was 1.25 times higher than that of the control group (<0.05). In the hepatopancreas, the expression ofreached its peak at 72 h after the injection of, which was 5.44 times higher than that of the control group (<0.05), and 12 h after the injection of WSSV. The peak value was 5.89 times higher than that of the control group (<0.05), and the expression was up-regulated as a whole. This study provides a reference for further understanding the physiological function of thegene in.

;; Low salinity stress;; WSSV

LIU Ping, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

S917

A

2095-9869(2020)04-0085-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190418001

http://www.yykxjz.cn/

王磊, 任憲云, 宋柳, 呂建建, 高保全, 劉萍, 孫東方. 三疣梭子蟹基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達分析.漁業科學進展, 2020, 41(4): 85–93

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* 國家蝦蟹產業技術體系(CARS-48)、國家自然科學基金面上項目(41876186)、江蘇省重點研發計劃(面上項目) (BE2017325)和中國水產科學研究院基本科研業務費(2020TD46)共同資助[This work was supported by the National Shrimp and Crab Industry Technology System (CARS-48), National Natural Science Foundation of China (41876186), Key Research and Development Plan of Jiangsu Province (BE2017325), and Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS (2020TD46)]. 王 磊，E-mail: 1006966437@qq.com

劉 萍, 研究員, E-mail: liuping@ysfri.ac.cn

2019-04-18,

2019-05-15

(編輯 馮小花)