珠江流域9個大鱗副泥鰍群體遺傳多樣性的微衛星分析*
2020-07-26 09:53:38高風英曹建萌劉志剛盧邁新
漁業科學進展 2020年4期
劉 潔 高風英 陳 剛 曹建萌 劉志剛 王 淼 盧邁新
珠江流域9個大鱗副泥鰍群體遺傳多樣性的微衛星分析*
劉 潔1,2高風英1①陳 剛2曹建萌1劉志剛1王 淼1盧邁新1①
(1. 中國水產科學研究院珠江水產研究所 農業農村部熱帶亞熱帶水產資源利用與養殖重點實驗室 廣州 510380；2. 廣東海洋大學水產學院 湛江 524025)
為探索我國珠江流域大鱗副泥鰍()群體的遺傳分化及親緣關系，本研究采用8個微衛星分子標記，對我國珠江流域9個大鱗副泥鰍群體(佛山、高要、封開、肇慶、乳源、樂昌、韶關、河源和惠州)進行了遺傳多樣性分析。結果顯示，8個微衛星位點共檢測到 69個等位基因，平均等位基因(a)和有效等位基因(e)分別為8.6和4.0個，平均觀測雜合度(o)和期望雜合度(e)分別為0.4426和0.7030。9個大鱗副泥鰍群體間的遺傳分化系數(st)和基因流(m)分別為0.2452和0.7697，表明群體間遺傳分化水平較高，遺傳交流水平低。采用UPGMA法，對 9個群體基于遺傳距離進行聚類，可分為兩大支，韶關、佛山和乳源群體聚為一支；另一支包含了其余的6個大鱗副泥鰍群體，分為3個小分支，分別為樂昌與肇慶群體、河源與惠州群體及高要與封開群體。研究表明，珠江流域的9個大鱗副泥鰍群體具有較高的遺傳多樣性，且群體間存在著一定的遺傳分化，具有進一步選育的價值。
大鱗副泥鰍；微衛星；遺傳多樣性
大鱗副泥鰍()主要分布于我國東部地區的河流、水田及湖泊水域，其外部形態與泥鰍()極為相似(杜啟艷等, 2007)。大鱗副泥鰍肉質細嫩、味道鮮美、營養豐富，素有“水中人參”之稱(趙睿等, 2014)。近年來，我國向日本、韓國出口大量大鱗副泥鰍，隨著市場需求的增加，大鱗副泥鰍的養殖規模也不斷擴大，而良種選育工作的滯后使苗種的人工繁育量已不能滿足養殖規模不斷擴大的需要(李彩娟等, 2014)。此外，環境污染和近親繁殖導致野生泥鰍的資源量銳減，種質資源不斷退化(邱楚雯等, 2017)。親魚捕撈后的異地養殖和人工養殖個體的逃逸干擾了泥鰍的自然分布和群體結構。因此，研究大鱗副泥鰍的遺傳多樣性，對合理開發和保護我國現有大鱗副泥鰍資源具有重要意義。
遺傳多樣性為生物多樣性的重要組成部分。一個群體或物種的遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，越能適應多變的環境，其進化潛力也越大(沈浩等, 2001)。對物種遺傳多樣性的數據分析，可為物種資源的開發和生物多樣性的保護提供科學依據(羅靜等, 2000)。遺傳多樣性的研究方法隨著遺傳學和分子生物學的發展，已到DNA分子水平。其中，微衛星又稱簡單重復序列(Simple sequence repeats, SSR)，是指以少數幾個核苷酸(2~6)經多次重復組成的簡單串聯重復序列(劉萍等, 2008)。SSR具有高多態性、共顯性、穩定性強等優點，被廣泛應用于水產動物遺傳多樣性評估、遺傳結構和親緣關系分析等研究中(王軍等，2018; 李可等, 2018; 葉竹青等, 2015; 蘇天鳳等, 2010)。目前，有研究用到微衛星技術對我國各地區大鱗副泥鰍進行遺傳多樣性分析。李彩娟等(2014)采用17個多態性微衛星標記，發現四大湖泊大鱗副泥鰍自然群體具有豐富的遺傳多樣性。游翠紅等(2012)篩選出6對微衛星引物，對我國長江水系及廣州地區的7個野生大鱗副泥鰍群體遺傳結構分析顯示，大鱗副泥鰍種群遺傳多樣性較低。珠江流域大鱗副泥鰍群體遺傳多樣性分析還未見報道。
本研究采用8個微衛星，對我國珠江流域共9個群體大鱗副泥鰍的遺傳多樣性與遺傳分化進行研究，充分探索大鱗副泥鰍的遺傳背景，以期為其種質資源保護策略的制定以及良種選育基礎群體的選擇提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
2017年8~10月于珠江水系采集泥鰍活體，采集后于中國水產科學研究院珠江水產研究所實驗室暫養，取尾鰭并保存于無水乙醇中。9個大鱗副泥鰍群體野生樣品分別采自珠江流域的西江(佛山，24尾；高要，30尾；封開，35尾；肇慶，27尾)、北江(乳源，25尾；樂昌，30尾；韶關，34尾)和東江(河源，29尾；惠州，20尾) (圖1)，共計254尾個體。
鑒別泥鰍和大鱗副泥鰍的特異性引物：上游引物(5′CCGCCCAGGAGTATTTTATG3′)；下游引物(5′TGGCATTTCATCAGGGGTG3′) (侯吉倫等, 2015)。8個微衛星(Mac37、Mac45、Mac49、Mac60、Mac425、Mac456、Mac576和Mac627)摘自泥鰍微衛星連鎖圖譜中等位基因較多的位點(Kagayaki, 2008)，擴增片段長度為100~300 bp，便于電泳分型。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 實驗方法
1.2.1 基因組DNA的提取 使用美基DNA提取試劑盒提取泥鰍尾鰭基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠120 V電泳20 min檢測所提DNA質量；用微量分光光度計檢測DNA濃度和質量；加ddH2O稀釋DNA至50 ng/μl，–20℃保存備用。
圖1 大鱗副泥鰍采集地點()
FS：佛山；GY：高要；FK：封開；ZQ：肇慶；RY：乳源；LC：樂昌；SG：韶關；HY：河源；HZ：惠州
FS: Foshan; GY: Gaoyao; FK: Fengkai; ZQ: Zhaoqing; RY: Ruyuan; LC: Lechang; SG: Shaoguan; HY: Heyuan; HZ: Huizhou
1.2.2 泥鰍和大鱗副泥鰍鑒別 用鑒別引物進行PCR擴增，PCR反應體系(25 μl)：50 ng/μl DNA模板2.5 μl，10 μmol/L上下游引物各2.5 μl，10×LA PCR Buffer(含Mg2+）2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μl，5 U/μl LADNA聚合酶0.25 μl，ddH2O 12.75 μl。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火90 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠120 V電泳20 min，檢測PCR擴增產物，電泳圖譜顯示，被測樣品條帶大小鑒別泥鰍(285 bp)和大鱗副泥鰍(214 bp)。
1.2.3 PCR擴增 采用10對微衛星引物進行PCR擴增，同時，篩選最佳的退火溫度。PCR反應體系(20 μl)：50 ng/μl DNA模板1.0 μl，10 μmol/L上下游引物各0.2 μl 2×EasyTaq?PCR SuperMix for PAGE 10.0 μl，ddH2O 8.6 μl。PCR反應程序：94℃預變性 3 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s， 23個循環；72℃延伸5 min。各對引物的特異退火溫度見表1。
表1 本研究使用的微衛星位點及其相關信息
Tab.1 Microsatellites used in this study and their associated information
*：(X)代表核心序列重復次數
*: (X)means repeat number of core sequence
1.2.4 聚丙烯凝膠電泳及銀染 擴增產物經12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，上樣量為5 μl，內外電泳槽中各加適量的1×TBE電泳緩沖液，50 V電泳30 min后再150 V電泳150 min。銀染參考徐紹斌等(2002)的方法并適當調整，同一位點等位基因由大到小記為A、B、C…V。
1.2.5 數據分析 使用Popgene32 1.32軟件分析各微衛星基因座的等位基因數(Number of allele,a)、有效等位基因數(Effective mumber of allele,e)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,o)、期望雜合度(Expected heterozygosity,e)、群體內近交系數(Fixation index,is)、遺傳分化系數(Genetic differentiation coefficient,st)、基因流(Number of migrants per generation,m)、遺傳距離(Genetic distance,A)、遺傳相似系數(Genetic similarity index,) (Kagayaki, 2008)，使用PIC-CALC 0.6軟件計算各位點的多態信息含量(Polymorphism information content, PIC)。
基于群體間Nei氏標準遺傳距離，使用MEGA6.0構建7個群體UPGMA(Unweighted pair group method with arithmetic means)系統進化樹。
2 結果
2.1 泥鰍和大鱗副泥鰍鑒別
鑒別引物在所有樣品中均能擴增出清晰的條帶，且能根據PCR擴增的產物片段大小來區分泥鰍(285 bp)和大鱗副泥鰍(214 bp)。部分大鱗副泥鰍鑒定的電泳結果見圖2。
圖2 大鱗副泥鰍鑒定的部分電泳結果
2.2 微衛星引物的PCR擴增
選取的10對泥鰍微衛星引物在9個大鱗副泥鰍群體中，有8對能擴增出清晰的條帶，且重復性好，在12%非變性聚丙烯酰胺凝膠上能分離等位基因。帶型統計分析后發現，8個微衛星位點共獲得了69個等位基因，微衛星基因座的等位基因范圍為5~15個，平均每個位點檢測出8.6個等位基因，其中，Mac49存在等位基因最少(5個)，Mac456最多(15個)。部分位點的電泳結果見圖3。
2.3 9個大鱗副泥鰍群體遺傳多樣性
從表2可以看出，8個微衛星位點的平均觀測等位基因為8.6個，平均有效等位基因數為4.0個，平均觀測雜合度為0.4426，平均期望雜合度為0.7030。8個位點在9個大鱗副泥鰍群體中表現出不同水平的多態。參照Botstein等(1980)提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標，除位點Mac45和Mac49為中度多態(0.25
圖3 位點Mac425和Mac576的部分電泳結果
表2 8個微衛星位點總遺傳參數
Tab.2 Total genetic parameters of 8 microsatellite loci
從表3可見，9個大鱗副泥鰍群體的等位基因數差別較小，其中，高要群體的等位基因數(a)最少(2.25)，韶關群體最多(5.38)；有效等位基因數(e)高要群體最少(1.98)，韶關群體最多(3.15)；各群體平均觀測雜合度(o)為0.3307~0.5626；期望雜合度(e)為0.3499~0.6144；PIC為0.4629~0.6777，其中，樂昌和河源群體表現為中度多態，其余7個群體表現為高度多態。
2.4 9個大鱗副泥鰍群體間的遺傳相似度和遺傳距離
遺傳距離和遺傳相似性指數是衡量群體親緣關系遠近的重要指標(朱滔等, 2013)。根據Nei指數法計算9個泥鰍群體間遺傳相似性指數和遺傳距離(表4)。9個大鱗副泥鰍群體間遺傳相似度為0.1965~0.9467，遺傳距離為0.0548~1.6271。肇慶與樂昌群體的遺傳相似度最高(0.9467)，遺傳距離最近(0.0548)；高要與乳源群體的遺傳相似度最低(0.9467)，遺傳距離最遠(1.6271)。
根據遺傳距離運用UPGMA法對7個泥鰍群體進行了聚類分析。系統樹結果表明(圖4)，9個大鱗副泥鰍群體分為兩大支。其中，韶關和佛山群體聚在一起，再與乳源群體聚為一支；另一支包含了其余的6個大鱗副泥鰍群體，其中，樂昌與肇慶群體聚為一支，河源與惠州群體聚為一支，這2個分支聚為一個分支后，再與高要和封開群體的這個分支聚為一大分支。
表3 8個微衛星位點在9個大鱗副泥鰍群體中的遺傳多樣性參數
Tab.3 Genetic diversity indices of 8 microsatellite loci in 9 P. dabryanus populations
表4 9個大鱗副泥鰍群體的遺傳相似性(對角線之上)與遺傳距離(對角線之下)
Tab.4 Genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) among 9 P. dabryanus populations
圖4 基于Nei′s無偏遺傳距離構建的9個大鱗副泥鰍群體UPGMA樹
3 討論
3.1 微衛星引物多樣性
本研究8個微衛星位點多態性豐富，共獲得 69個等位基因，平均等位基因為8.6個，與游翠紅等(2012)利用6對泥鰍微衛星引物跨種擴增大鱗副泥鰍，每個位點檢測出的平均等位基因數相近。PIC可反映基因座位變異程度的高低，同時，也關系到該位點的可用性和使用效率，PIC越大，提供的遺傳信息越高，越具有可用性(邢晶晶, 2012)。本研究的8個微衛星位點中，除Mac45和Mac49兩個位點為中度多態(0.25
3.2 種內遺傳多樣性
9個大鱗副泥鰍群體平均PIC為0.5602，其中，樂昌和河源群體表現為中度多態，其余7個群體PIC均高于0.5，表現為高度多態，具有進一步選育的潛力。李雅娟等(2010)采用5個微衛星分子標記對我國3種野生泥鰍進行分析顯示，平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.8696和0.7283，平均多態信息含量為0.6193，均高于本研究結果的平均觀測雜合度(0.4477)、期望雜合度(0.5409)和PIC(0.5602)，在一定程度反映出泥鰍的遺傳多樣性高于大鱗副泥鰍。Dewoody等(2000)采用微衛星標記對13種淡水魚進行分析，得出平均期望雜合度為0.46，與本研究結果中9個大鱗副泥鰍的平均期望雜合度相近。李彩娟等(2014)采用 17個微衛星分子標記，分析四大湖泊大鱗副泥鰍的平均期望雜合度為0.577，高于本研究的結果，可能研究對象中有一部分個體為逃逸到野生環境中的養殖個體的原因。
3.3 遺傳分化與親緣關系
遺傳分化指數(st)是評價群體間遺傳分化程度的重要指標，本研究中9個大鱗副泥鰍群體的遺傳分化指數均值為0.2452，表明群體間遺傳分化水平較高(劉志剛等, 2018)。丁海燕等(2015)利用6個微衛星標記分析我國泥鰍，遺傳分化指數均值為0.4990，高于本研究的遺傳分化指數值，多種原因可造成遺傳分化的嚴重，人類活動造成的遺傳漂變可能是最主要的原因。Wright(1931)認為，基因流指數m>1，基因流則能發揮均質化作用，即能有效抑制種群間遺傳分化的產生；m<1時，則表明各亞群間基因流受阻，群體可能走向遺傳分化。本研究中8個座位的m均值為0.7697(m<1)，表明9個群體間基因交流水平低，進而導致遺傳分化程度較高。這可能也是由于大鱗副泥鰍自身遷移能力有限、地理距離、自然屏障的隔離和自然選擇等導致了較大程度的遺傳分化(王坤, 2009)。
聚類分析結果顯示，9個大鱗副泥鰍群體大多數按地理位置聚類。乳源和韶關群體位于珠江水系的北江及其支流，與其他地區群體因地理距離遠而缺乏基因交流，使得與其他地區間遺傳距離較大，在聚類圖上這2個大鱗副泥鰍群體聚為一大支與其他6個群體分開。另外的一大支中，位于珠江東江流域的河源和惠州群體聚在一起，位于珠江西江流域的高要和封開群體聚在一起。在游翠紅等(2012)對我國7個大鱗副泥鰍群體的研究中發現，多個地區群體也表現出相似的遺傳分化現象。可見地理隔離是影響大鱗副泥鰍群體間遺傳分化的主要原因。但在9個群體中，樂昌群體屬于珠江水系的北江，卻與位于珠江西江流域的肇慶群體遺傳相似度最高(0.9467)，遺傳距離最近(0.0548)。此外，位于珠江水系西江的佛山群體與位于珠江北江的韶關群體的遺傳距離(0.2201)也較近。單磊等(2009)對長江中下游泥鰍的遺傳多樣性的研究也發現，武漢和太湖群體之間地理位置較遠而遺傳關系較近，表現出遺傳距離與地理距離不一致的現象。丁海燕等(2015)對我國7個泥鰍群體的遺傳多樣性研究也表明，四大流域東部盆地各泥鰍群體遺傳距離卻與地理距離沒有明確的關聯性。這說明人類活動或養殖行為可能在一定程度上擾動了泥鰍資源的分布，也可能與實驗樣品量不足有關，后續應擴大采樣范圍和增加實驗群體。本研究中，9個珠江水系的大鱗副泥鰍群體具有較高的遺傳多樣性，且群體間存在一定的遺傳分化，可對其進行種質保護，防止與其他苗種混雜，造成種質退化。
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Genetic Diversity Analysis of Nine Loach () Populations in the Pearl River Basin Based on Microsatellite Markers
LIU Jie1,2, GAO Fengying1①, CHEN Gang2, CAO Jianmeng1, LIU Zhigang1, WANG Miao1, LU Maixin1①
(1. Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fishery Resource Application and Cultivation, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangzhou 510380;2. College of Fisheries, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524025)
Human activities and environmental pollution have caused varying degrees of damage toresources in China. To explore the genetic differentiation and phylogenetic relationship of.populations in China’s Pearl River Basin, eight microsatellite markers were used to analyze the genetic diversity of nine geographicalpopulations (Foshan, Gaoyao, Fengkai, Zhaoqing, Ruyuan, Lechang, Shaoguan, Heyuan, and Huizhou) of.in the Pearl River Basin. The analysis detected 69 alleles in eight microsatellite loci. The average number of alleles (a) and effective alleles (e) per locus were 8.6 and 4.0, respectively, and the average observed heterozygosity (o) and expected heterozygosity (e) were 0.4426 and 0.7030, respectively. The average genetic differentiation coefficient (st) and number of migrants per generation (m) of the nine.populations were 0.2452 and 0.7697, respectively, which indicates that genetic differentiation among populations was high and genetic communication was low. Cluster analysis was performed by the unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA) method, based on the genetic distance among nine populations. The resulting UPGMA tree was divided into two main branches. The Shaoguan, Foshan, and Ruyuan populations were monophyletic and formed oneclade. The remaining six.populations formed the other branch, which contained three smaller branches, which were composed of the Lechang and Zhaoqing populations, the Heyuan and Huizhou populations, the Gaoyao and Fengkai populations. These results suggest that the genetic diversity of nine.populations in the Pearl River Basin was high, and there was a certain genetic differentiation among the populations, which could be used for further breeding.
; Microsatellite; Genetic diversity
GAO Fengying, E-mail: fengyinggao2011@163.com;LU Maixin, E-mail: mx-lu@163.com
S931.5
A
2095-9869(2020)04-0050-08
10.19663/j.issn2095-9869.20190731002
http://www.yykxjz.cn/
劉潔, 高風英, 陳剛, 曹建萌, 劉志剛, 王淼, 盧邁新. 珠江流域9個大鱗副泥鰍群體遺傳多樣性的微衛星分析. 漁業科學進展, 2020, 41(4): 50–57
Liu J, Gao FY, Chen G, Cao JM, Liu ZG, Wang M, Lu MX. Genetic diversity analysis of nine loach () populations in the Pearl River Basin based on microsatellite markers. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 50–57
* 現代農業產業技術體系專項資金(CARS-46)資助[This work was supported by China Agriculture Research System (CARS-46)]. 劉 潔，E-mail: ljie0624@163.com
高風英，副研究員，E-mail: fengyinggao2011@163.com；盧邁新，研究員，E-mail: mx-lu@163.com
2019-07-31,
2019-08-15
(編輯 馮小花)
