環境條件對1株假交替單胞菌脫氮效果的影響*

于黨輝 王秀華 張宇哲 武和英 張 琴

環境條件對1株假交替單胞菌脫氮效果的影響*

于黨輝1,2王秀華2,3①張宇哲2武和英2張 琴4

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室 青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071；3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；4. 廣西壯族自治區海洋研究所 廣西海洋生物技術重點實驗室 北海 536000)

從對蝦養殖池中分離得到1株具有高效脫氨氮能力的菌株(2906)，根據菌株2906的16S rRNA序列分析，該菌與假交替單胞菌屬的親緣關系最近，命名為假交替單胞菌(sp.)2906。利用不同C/N、pH、鹽度的脫氮培養基，分析了環境條件對該菌株脫氮效率的影響，研究了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、乳糖和可溶性淀粉等不同碳源對菌株2906脫氮效果的影響。結果顯示，菌株2906在C/N為15~20、pH為7~8、鹽度為5~15時，具有良好的脫氨氮效果。應用檸檬酸鈉為碳源，氨氮去除率達100%。在脫氮培養過程中，細菌生長與脫氮效率呈強相關性(相關系數=0.94)。采用浸泡攻毒方法測試了該菌對幼蝦的生物安全性，結果顯示，該菌對幼蝦的LC50為2.8′107CFU/ml，表明該菌對對蝦不具致病力。研究結果可為該菌的開發利用提供技術支持。

假交替單胞菌；C/N；鹽度；pH；碳源；氨氮；脫氮效率

對蝦養殖業是我國漁業經濟的重要支柱產業，目前，國內對蝦養殖年產量已突破100萬t，產值超過600億元(農業農村部科技教育司等, 2018)，但經過10余年的快速發展，現已進入疾病高發期，因各類疾病導致的養殖對蝦年損失已超過百億元(農業農村部漁業漁政管理局等, 2018)。對蝦疾病的暴發與養殖環境關系極為密切，良好的養殖環境能減少疾病發生。然而，近年來由于養殖用地縮減，市場需求增大，對蝦養殖密度普遍提高，養殖中后期水體殘餌、糞便積累增多，導致水體氨氮、亞硝基氮濃度過高，給養殖對蝦帶來了潛在的危害。研究發現，過高濃度的氨氮不僅對對蝦具有直接的生物毒性(Barbieri, 2010)，而且會降低對蝦的免疫力(Liu, 2004)，影響其正常的生理代謝(Racotta, 2000)。

采用益生菌改善養殖環境、提高養殖動物抗病力，是近年來水產養殖領域中的研究熱點之一。自然環境中存在大量的功能性微生物，具有殺菌(Luis- Villase?or, 2011; Liu, 2015)、提高對蝦免疫力(Ochoa-Solano, 2006)、降解氨氮、亞硝基氮(Song, 2011; 胡修貴等, 2013; 王越等, 2019)等功能。其中，具有脫氮功能的微生物種類較多，廣泛分布于土壤、海水和淡水水域及水產養殖系統中 (沈李東等, 2011; 王磊等, 2016)，在促進生態系統氮循環中發揮重要作用。

本研究從山東省濰坊市一家對蝦養殖場分離到 1株具有較高脫氮能力的細菌，研究了該菌在不同鹽度、pH、碳源及C/N條件下對氨氮及亞硝基氮的去除能力，采用16S rRNA序列比對方法對該菌進行了初步的分類鑒定，同時，對該細菌進行了生物安全性評價，以期為該菌的開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗用對蝦及飼養管理

菌株安全性評價所用凡納濱對蝦()購于山東省濰坊市一家對蝦養殖場，其平均體長為(4.0±0.4) cm，實驗前，于養殖池中暫養2周，水溫為27.0℃，鹽度為28.0，pH為7.4，溶解氧(DO)> 5.0 mg/L。

1.2 脫氮培養基

硝化培養基的配方參照孫振(2013)，經預實驗篩選確定碳源為蔗糖，硝化培養基配方(g/L)：蔗糖6.21，NH4Cl l0.5，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.01，KH2PO40.5，EDTA (0.5 mol/L) 0.5 ml，Na2HPO40.5，FeSO40.01，NaCl l20，微量元素溶液為5 ml，pH為7.0~7.5。

微量元素溶液配制(g/L)：EDTA 50，ZnSO42.2， MnCl2·4H2O 5.06，FeSO4·7H2O 5.0，CuSO4·5H2O 1.57，CaCl25.5，(NH4)6Mo7O24·4H2O 1.1，CoCl2·6H2O 1.61，pH 7.0，培養基中的C/N接近20。115℃高壓蒸汽滅菌20 min (在其他成分滅菌完成后，NH4Cl經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后再加入)，固體培養基在未滅菌之前加入20%的瓊脂粉。

1.3 菌株的采集與分離

從山東省濰坊市的室外凡納濱對蝦養殖池中采集水樣，裝入無菌采樣管中低溫保存，帶回實驗室后采用Zobell 2216E(蛋白胨5 g/L、酵母膏1 g/L、FePO40.01 g/L、瓊脂20 g/L、陳海水1 L，pH 7.8)平板劃線法分離純化，對所有菌株進行編號，–70℃保存備用。

1.4 脫氮菌株的篩選

將分離純化后的菌株采用劃線方法接種到硝化固體培養基上，28℃培養箱培養48 h，根據菌株的生長情況進行篩選。將篩選出的菌株接種至硝化液體培養基中，置于28℃150 r/min的搖床，培養48 h后測定培養基中氨氮濃度，計算各菌株脫氮效率，篩選脫氮效率最高者用于后續研究。

氨氮的測定采用次溴酸鹽氧化法，亞硝基氮測定采用萘乙二胺分光光度法(海洋監測規范第4部分) (GB 17378.4-2007)。氨氮去除率的計算按照公式：

氨氮去除率(%)=(初始氨氮濃度–剩余氨氮濃度)/初始氨氮濃度′100%

1.5 菌株脫氮能力測定及其與菌株生長相關性分析

以蔗糖為碳源，配制C/N為20、鹽度為15，pH為7.0~7.5，氨氮濃度分別為10、20、30、40和50 mg/L的硝化培養基。平板計數法測定細菌濃度，制定菌液OD值與細菌濃度的工作曲線，根據工作曲線配制濃度為107CFU/ml的菌液，以3%的接種量接入硝化液體培養基中，在28℃，150 r/min的恒溫搖床中振蕩培養，每隔4 h取樣1次，部分樣品用于測定OD600 nm值，剩余樣品經3000×g離心10 min后，測定培養基上清液中的氨氮含量和各組菌液中氨氮濃度，每組設置3個平行。

菌株OD600 nm與脫氮效率相關性分析：依據5個氨氮濃度組在每個取樣時間點的平均OD值及平均脫氮效率，進行相關性分析，確定相關系數。

1.6 不同碳源對實驗菌脫氮效果的影響

為優化脫氮菌碳源，分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、丁二酸鈉、檸檬酸鈉、a-乳糖和可溶性淀粉為碳源，配制氨氮濃度為20 mg/L，C/N為20的硝化液體培養基。將濃度為1.0′107CFU/ml菌液以3%的接種量接種于含不同碳源的液體硝化培養基中，28℃150 r/min的恒溫搖床培養，每隔4 h取樣1次，每組設3個平行。

1.7 不同鹽度對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配制氨氮濃度為20 mg/L、C/N為20的硝化液體培養基，用NaCl調節培養基的鹽度分別為5、15、25、35和45。參照1.5的培養及分析方法，測量各鹽度組菌株的脫氮效果，每組設3個平行。

1.8 不同pH對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配制氨氮濃度為20 mg/L、C/N為20、鹽度為15的液體硝化培養基，分別用0.1 mol/L的HCl和NaOH溶液調節液體培養基的初始pH，使其初始值分別為5、6、7、8和9。參照1.5的培養及分析方法，測量各pH組菌株的脫氮效果，每組設 3個平行。

1.9 不同C/N對實驗菌株脫氮效果的影響

以蔗糖為碳源，配制氨氮濃度為20 mg/L、鹽度為15的液體硝化培養基5組，通過調節蔗糖濃度，使各組的C/N分別為5、10、15、20和25。參照1.5的培養及分析方法，測量各組菌株的脫氮效果，每組設3個平行。

1.10 菌株生物安全性評價

待測菌株用Zobell2216E液體培養基發酵24 h后，3000×g 4℃離心10 min，棄上清液，用PBS重懸稀釋成菌懸液，然后在5個10 L的塑料桶內，用過濾海水將菌液分別稀釋成濃度分別為1′104、1′105、1′106、1′107和1′108CFU/ml感染用菌液各5 L。在每桶中放入10尾凡納濱對蝦浸泡感染，12 h后換水50%，之后每24 h換水30%，正常投喂養殖管理，全程充氣，記錄對蝦的攝食、脫皮、活力及存活情況，至對蝦穩定1周后，停止記錄。

1.11 菌株初步鑒定

采用16S rRNA序列分析比對和系統發育分析確定菌株的分類：菌株16S rRNA PCR序列擴增所用引物及程序參照Wan等(2013)，PCR擴增產物測序委托上海桑尼生物科技有限公司，所得序列經NCBI Blast比對分析，選取同源性較高的序列，利用MEGA 6.0構建系統發育樹，確定篩選菌株的分類地位。

1.12 數據分析

采用Excel 2013軟件對實驗數據進行統計及相關性分析。采用SPSS16.0軟件計算細菌感染半致死濃度。

2 結果

2.1 脫氮菌株的篩選

從對蝦養殖池中共分離出32株菌株，經脫氮效果檢測，菌株2906脫氨氮效率達(92.1±2.4)%，為所選菌株中最高者。該菌株在2216E培養基上培養24 h，菌落直徑為1~2 mm，邊緣整齊、表面扁平，菌株淡綠色、半透明，選該菌為目標菌株用于后續研究。

2.2 菌株脫氨氮能力測定、菌株生長與脫氨氮率的相關性

接種菌株2906于不同氨氮濃度的硝化培養基中，其脫氮效率見圖1。從圖1可以看出，在測試的氨氮濃度范圍內，該菌株均表現出一定的脫氮能力，32 h時對濃度為10 mg/L的氨氮去除率達(98.9±0.8)%，對濃度為50 mg/L的氨氮去除率達(52.4±0.6)%。

圖1 菌株2906對不同濃度氨氮的去除率

菌株氨氮去除率與OD值的關系見表1，相關性分析顯示，其二者的相關系數為0.94，具有強相關性，表明菌株增殖的過程也是代謝氨氮的過程。

2.3 不同碳源對實驗菌株脫氮效果的影響及發酵液中亞硝酸鹽檢測

菌株2906在7種不同碳源硝化培養基中的脫氮效率見圖2。從圖2可以看出，以檸檬酸鈉為碳源的培養基在20 h時脫氮效率達100%；以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養基在32 h時其脫氮效率接近100%；可溶性淀粉為碳源時，菌株2906的脫氮效果最差，32 h時僅為(8.3±1.2)%，其他3種碳源組的32 h脫氮效率均低于(61.1±2.3)%。檢測各實驗組不同發酵時間段培養基中亞硝酸鹽濃度，結果顯示，測試的發酵液中均未有亞硝酸鹽檢出，即氨氧化不產生亞硝酸鹽。

2.4 鹽度對實驗菌株生長及脫氮效果的影響

菌株2906在不同鹽度的硝化培養基中脫氮效率見圖3。從圖3可以看出，該菌株在鹽度為5的培養基中脫氮效率最高，在28 h到達最高脫氮效率，為(94.1±2.0)%；在鹽度為15的培養基中，32 h脫氮效率達(91.3±4.3)%；在鹽度為25的培養基中，32 h時的脫氮效率僅為(45.4±3.3)%；而在鹽度為35和45的培養基中，32 h時的脫氮效率分別為(2.06±1.8)%和(1.9±0.4)%，基本不具備脫氮能力。

表1 不同氨氮組中各采樣時間點菌液OD600 nm和脫氮效率

圖2 碳源對菌株2906脫氮率的影響

2.5 初始pH對實驗菌株生長及脫氮效果的影響

菌株2906在不同初始pH硝化培養基中的脫氮效率見圖4。從圖4可以看出，實驗菌株在初始pH為8和7的培養基中32 h時具有最高的脫氮效率，分別為(88.9±6.0)%和(76.8±3.2)%；在初始pH為5和6的培養基中脫氮效率較低，在32 h時分別為(12.7±0.7)%和(24.6±2.8)%；在初始pH為9的培養基中脫氮效率僅為(25.1±2.4)%。

2.6 C/N對實驗菌株脫氮效果的影響

菌株2906在不同C/N硝化培養基中的脫氮效率如圖5所示，在C/N為20的硝化培養基中，菌株的脫氮效率最高，發酵28 h脫氮效率即可達100%；C/N為15時，菌株脫氮效率次之，在32 h時脫氮效率均達100%；C/N為5時最差，發酵32 h脫氮效率僅為(53.6±3.5)%。

2.7 實驗菌株安全性實驗評價

使用菌株2906浸泡感染對蝦，結果顯示，高濃度菌液(108CFU/ml)組的對蝦在第3天全部死亡，其他4個濃度組到實驗第10天均存活，且在實驗期間攝食、脫皮正常，反應靈敏。根據死亡率計算可知，該菌株的LC50為2.8×107CFU/ml。

2.8 菌株鑒定

對菌株2906進行PCR擴增測序，得到長為1440 bp序列，將擴增產物序列進行BLAST序列比對(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，結果顯示，該菌與多株假交替單胞菌屬細菌(spp.)親緣關系最近，且與菌株在一個分支上，同源性達99.5%以上，選取與該菌株相近的11株菌的核酸序列構建系統發育樹，判定該菌為1株假交替單胞菌(圖6)。

圖3 鹽度對實驗菌株脫氮率的影響

圖4 初始pH對實驗菌株脫氮效率的影響

圖5 C/N對實驗菌株脫氮效率的影響

圖6 根據菌株2906 16S rRNA序列與相近的菌株構建系統發育樹

節點數為bootstrap支持率，1000次重復

The number of nodes is bootstrap support rate of 1000 repetitions

3 討論

假交替單胞菌屬為1995年確立的1個新的細菌屬(Gauthier, 1995)，該屬的細菌因具有分泌生物活性物質及多共生于海洋動植物體上的特性，引起了研究者的廣泛關注。目前，已發現的該屬細菌中有 20余種能產生活性物質，其功效包括降解瓊膠、抗細菌、抗真菌、殺菌、促進水生動物幼體附著等(Holmstr?m, 1999, 張歡歡等, 2016)。王磊等(2016)從對蝦腸道中分離出的1株假交替單胞菌，具有抗弧菌及脫氮功能，應用于對蝦養殖中，能夠顯著降低水體中的氨氮濃度。本研究從對蝦養殖水體中分離出的菌株2906為適應低鹽度(5~15)的菌株，在pH為7~8時，具有較強的脫氨氮能力，而該環境條件為對蝦養殖的適宜條件，且該菌對對蝦表現出良好的生物安全性，因此，可將該菌株應用于對蝦養殖系統中，發揮其脫氮功能。

氨氧化細菌多為自養細菌，廣泛存在于土壤、湖泊及其底泥、海洋等環境中，但該類細菌極難培養(董蓮華等, 2008)。近年來，關于厭氧氨氧化細菌的報道較多，厭氧氨氧化細菌能夠在厭氧環境中，同時以NH4+作為電子供體，NO2–作為電子受體，將氨氮和亞硝酸氮轉化為N2(Mulder, 1995)。目前，在海洋中發現的該類細菌均屬于浮霉菌綱，各種之間分類學距離較遠，發現海洋中主要種類為(魏海峰等, 2014)。本研究篩選的菌株2906為異養硝化細菌，能夠利用檸檬酸鈉、蔗糖、葡萄糖等有機碳源。迄今為止，已報道的異養硝化細菌主要在假單胞菌屬() (Koschorreck, 1996)、鹽單胞菌屬()(張歡歡, 2015)、不動桿菌屬() (Yang, 2015)、產堿桿菌屬() (van Neil, 1992)、副球菌屬() (Shi, 2013)及克雷伯氏菌屬() (Padhi, 2013)等屬中，假交替單胞菌屬細菌具有脫氮功能的相關報道較少，該屬細菌的脫氮機理仍需后續研究。

異養硝化細菌脫氮過程與其所處的環境理化因子及營養物質有密切的關系，不同的菌株在不同的環境和營養條件下生長存在差異，適宜的碳源與鹽度(Reddy, 2014)、pH (Fajardo, 2014)、C/N (Karanasios, 2016)、溶解氧(Meng, 2008)和溫度(Capua, 2017)等能顯著提高脫氮效果。本研究對所篩選的菌株進行脫氨氮條件比較顯示，菌株2906能夠有效利用檸檬酸鈉、蔗糖及葡萄糖等有機碳，高效去除氨氮，且在氨氧化過程中，不產生亞硝酸鹽，表明該菌為異養硝化菌。異養硝化菌在氨代謝過程中，由氨單氧酶(Ammonia monooxygenase)催化氨形成羥胺后，經非血紅素鐵羥胺氧化酶(Non-haem iron hydroxylamine oxidase)的催化，直接形成N2O和N2(Richardson, 1998)。與自養細菌的代謝機制存在差別。

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Effect of Environmental Conditions on Denitrification ofsp.

YU Danghui1,2, WANG Xiuhua2,3①, ZHANG Yuzhe2, WU Heying2, ZHANG Qin4

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao Key Laboratory of Mariculture Epidemiology and Biosecurity, Qingdao 266071;3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071;4. Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi, Guangxi Institute of Oceanology, Beihai 536000)

A bacterial strain with high denitrification activity isolated from a shrimp pond was designated strain 2906. The effects on denitrification efficacy of environmental conditions including carbon/nitrogen (C/N) ratio, pH, and salinity were determined using sucrose and ammonia as carbon and nitrogen sources, respectively. The effects ofcarbonsources (glucose, sucrose, maltose, sodium succinate, sodium citrate, lactose and soluble starch) on the denitrification efficacy of strain 2906 were assessed.The maximal NH4+-N removal rate of strain 2906 was achieved at a C/N ratio15~20, an initialpH of 7~8, and salinity of 5~15. Sodium citrate was the optimal carbon source, with which the NH4+-N removal rate reached 100%. In the process of denitrification, there was a strong correlation between bacterial density and denitrification efficiency (=0.94). A sequencing and phylogenetic analysis of the 16S rRNA of strain 2906 showed it was closely related tospp. The biosafety of strain 2906 was also tested on juvenile shrimp through an immersion challenge, with the result showing that the 50% lethal concentration of strain 2906 for juvenile shrimp was 2.8×107CFU/ml, which indicates that strain 2096 has no virulence to shrimp. The results provide a theoretical basis for the development and utilization of the bacterium.

sp.; C/N; Salinity; pH; Carbon source; NH4+-N; Denitrification efficacy

WANG Xiuhua, E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

S949

A

2095-9869(2020)04-0144-07

10.19663/j.issn2095-9869.20190330001

http://www.yykxjz.cn/

于黨輝, 王秀華, 張宇哲, 武和英, 張琴. 環境條件對1株假交替單胞菌脫氮效果的影響. 漁業科學進展, 2020, 41(4): 144–150

Yu DH, Wang XH, Zhang YZ, Wu HY, Zhang Q. Effect of environmental conditions on denitrification ofsp. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(4): 144–150

* 中國水產科學研究院黃海水產研究所級基本科研業務費(20603022018001)和廣西創新驅動發展專項(桂科AA17204044)共同資助[This work was supported by Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022018001), and Innovation-Driven Development Special Fund Project of Guangxi (AA17204044)]. 于黨輝，E-mail: 615763163@qq.com

王秀華，研究員，E-mail: wangxh@ysfri.ac.cn

2019-03-30,

2019-05-15

(編輯 馬璀艷)