高海拔地區傳統牦牛酥油中抗氧化乳酸菌的篩選

李丹丹 蔣婷婷 張 炎 羅 章

(1. 西藏農牧學院食品科學學院，西藏 林芝 860000；2. 甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

近年來，乳酸菌作為天然抗氧化劑，其緩解因氧化應激引發的各種疾病成為研究熱點[1]。氧化應激即機體生成或清除自由基的能力失衡，導致機體氧化損傷，出現衰老或病變的現象[2]，攝入外源性抗氧化劑是緩解機體氧化應激的重要途徑[3]。經過長期的自然選擇，西藏傳統乳制品中富含優良的乳酸菌，蔣厚陽等[4]從西藏奶酪、酸奶中篩選得到12個乳酸菌菌種，驗證了乳制品中乳酸菌的多樣性。青藏高原嚴寒缺氧、強紫外輻射的惡劣環境脅迫機體長期處于氧化應激狀態[5]，近年來對西藏牦牛酸乳中抗氧化乳酸菌的研究較多，陳明等[6]從青藏高原牦牛酸乳中篩選出3株乳酸菌，對DPPH自由基、OH自由基及超氧陰離子自由基均有較高的清除力。由此表明，西藏傳統乳制品中含有豐富的抗氧化乳酸菌。

牦牛酥油是藏區人民日常生活中必不可少的食物[7]。相較于牦牛酸乳中乳酸菌抗氧化活性的若干研究[8-9]，對同為西藏傳統牦牛乳制品的酥油中抗氧化乳酸菌的研究卻未見報道，并且酥油低溫加工的方式對乳酸菌的多樣性具有保護作用。試驗擬對采集自西藏高海拔地區牦牛酥油中的乳酸菌進行分離鑒定，篩選具備天然抗氧化發酵劑開發潛力的乳酸菌，以期豐富西藏牦牛酥油中乳酸菌的相關研究。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

西藏牦牛酥(樣品詳細信息見表1)：采集自西藏地區；

表1 樣品信息

細菌基因組DNA提取試劑盒：天根生化試劑公司；

MRS培養基(MRS固體培養基在MRS培養基基礎上添加1.5%的瓊脂；含7.5‰ CaCO3的MRS固體培養基是在MRS培養基基礎上添加7.5‰CaCO3和1.5%的瓊脂)：北京奧博星生物技術有限責任公司；

DPPH無水乙醇溶液(0.2 mmol/L)、鄰菲啰啉溶液(2.5 mmol/L)、pH 8.2 Tris-HCl(0.05 mol/L)、鄰苯三酚(0.05 mol/L)：上海源葉生物科技有限公司；

硫酸亞鐵溶液(2.5 mmol/L)、pH 7.4磷酸緩沖液(PBS)、過氧化氫溶液(20 mmol/L)：北京易秀博谷生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計：UV-1800型，上海美譜達儀器有限公司；

超聲波破碎儀：JY88-IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機：5810R型，德國Eppendorf公司；

PCR儀：BC-C57型，北京天林恒泰科技有限公司；

瓊脂糖水平電泳儀：DYCP-31DN型，北京六一儀器廠；

凝膠成像系統：Tanon 1600型，上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化 精確稱取酥油樣品5.00 g，置入裝有45 mL生理鹽水的無菌均質袋中，使用拍擊式均質器拍打1～2 min(拍擊速度6次/s)制成1∶9 (g/mL)的樣品勻液。將梯度稀釋后的樣液在含有7.5‰ CaCO3的MRS固體培養基上均勻涂布，置于37 ℃培養箱中恒溫培養48 h，選取有溶鈣圈現象的單菌落進行鏡檢和革蘭氏染色，將革蘭氏陽性菌純培養，置于-80 ℃保存備用[10]。

1.3.2 菌株分子生物學鑒定

(1) DNA提取：利用細菌DNA試劑盒提取分離得到的純菌落菌株DNA。

(2) PCR擴增及測序：根據文獻[11]，修改如下：

PCR體系(25 μL)：PCR Buffer 2.5 μL，d NTP 2 μL，DNA 模板1 μL，Taq酶0.3 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，用超純水定容至25 μL，備用。

PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s(40次循環)，最后72 ℃延伸5 min。

(3) 序列分析：利用Nucleotide Blast對比分析測序結果。

1.3.3 乳酸菌的耐酸性測定 將-80 ℃保存菌株以2%接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h，獲得試驗菌株。調整其細胞濃度為1×108CFU/mL，以體積分數3%的接種量分別接種于初始pH為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h，測其不同pH值下600 nm處的OD值[12]。

1.3.4 乳酸菌耐過氧化氫性能測定 將-80 ℃保存菌株以2%接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃培養16 h，獲得試驗菌株。調整其細胞濃度為1×108CFU/mL，以體積分數1%的接種量分別接種于初始H2O2濃度為0.0，1.0，2.0，3.0 mmol/L的MRS液體培養基中，37 ℃培養8 h，測其不同H2O2濃度下600 nm處的OD值[13]。

1.3.5 菌株抗氧化能力的復篩 吸取15 mL試驗菌株培養液與15 mL PBS緩沖液(pH 7.4)旋渦混勻，離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)洗滌3次，制得菌懸液，調整細胞濃度至109CFU/mL。將調整好細胞濃度的菌懸液平均分為兩份，其中一份菌懸液為乳酸菌完整細胞組，將另一份菌懸液利用超聲波破碎儀(變幅桿Φ6 mm，超聲開1 s，超聲關1 s，功率33%)冰浴破碎處理，取上清，即無細胞提取物。

(1) DPPH自由基清除力試驗方法：根據文獻[14]，取1 mL待測樣品(完整細胞組和無細胞提取物組)，加入1 mL DPPH無水乙醇溶液(0.2 mmol/L)，充分混勻后，室溫下避光靜置30 min，6 000 r/min 離心10 min。取上清液，517 nm下測定吸光度記錄數值為A。用1 mL 無水乙醇代替1 mL待測樣品，測定吸光度值為A0。用1 mL 無水乙醇代替1 mL DPPH無水乙醇溶液，測定吸光度值為A1。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

X——DPPH自由基清除率，%；

A——樣品組吸光度；

A0——對照組吸光度；

A1——空白組吸光度。

(2) OH自由基清除力試驗方法：根據文獻[15]，取1 mL鄰菲啰啉溶液(2.5 mmol/L)，依次加入1 mL PBS緩沖液(pH=7.4)，1 mL待測樣品(完整細胞組和無細胞提取物組)，充分混勻后加入1 mL硫酸亞鐵溶液(2.5 mmol/L)，混勻，加入1 mL過氧化氫溶液(20 mmol/L)，37 ℃恒溫水浴1.5 h，536 nm下測定吸光度記錄數值為A1。用1 mL蒸餾水代替1 mL過氧化氫溶液，測定吸光度值記錄為A0。用1 mL蒸餾水代替1 mL待測樣品，測定吸光度值記錄為A2。按式(2)計算OH自由基清除率。

(2)

式中：

X——OH自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

A1——樣品組吸光度；

A2——對照組吸光度。

(3) 超氧陰離子自由基清除力試驗方法：根據文獻[16]，取0.1 mL待測樣品(完整細胞組和無細胞提取物組)，加入4.5 mL Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)，充分混合均勻后，置于25 ℃水浴預熱20 min，加入0.4 mL鄰苯三酚(25 mmol/L)，再次于25 ℃水浴5 min后，立即滴入2滴HCl(8 mol/L)用以終止反應，320 nm下測定吸光度記錄數值為A。用0.1 mL蒸餾水代替0.1 mL待測樣品，測定吸光度值記錄為A0。按式(3)計算超氧陰離子自由基清除率。

(3)

式中：

X——超氧陰離子自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

A——樣品組吸光度。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離和初步鑒定結果

利用溶鈣圈法從樣品中分離得到61株菌株，對純菌株進行革蘭氏染色、鏡檢，菌株菌落形態為直徑0.7～3.0 mm、圓形或橢圓形、白色或乳白色、濕潤、突起或微隆起、邊緣整齊；革蘭氏染色無芽孢、均為陽性，溶鈣圈為陽性；檢出多為長桿狀或短桿狀，符合乳酸菌的特征。部分微生物菌落形態如圖1所示。

圖1 部分微生物的菌落形態

2.2 菌株分子生物學鑒定結果及系統發育分析

采用試劑盒法分離得到的單菌落純菌株的DNA，部分純菌株凝膠電泳圖如圖2所示。分離得到的61株菌株的電泳條帶長度均在1 500～1 750 bp，符合細菌電泳條帶長度要求。

M. DL5000 DNA Marker 1～7. 分別代表不同菌株

將61株菌株測序結果利用NCBI中的NucleotideBlast數據庫進行比對分析。鑒定結果表明，從牦牛酥油中分離得到的61株菌分屬乳酸菌屬的7個種，其中副干酪乳桿菌亞種(Lactobacillusparacaseisubsp.tolerans)9株；副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) 26株；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) 21株；德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii) 3株；鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus) 2株。菌株同源性均為99%。

將菌株測序結果，利用Mega 7.0軟件構建菌株系統發育樹如圖3所示。由圖3可知，菌株A4和B5，C10、C19和C20，D1、D2和D3等遺傳距離較近，表明這些菌株的親緣關系比較接近，而其他菌株的遺傳距離較遠，說明這些菌株之間差異較大。此外，通過系統發育樹驗證西藏牦牛酥油中乳酸菌的多樣性。

圖3 牦牛酥油中微生物的系統發育樹

2.3 菌株耐受性試驗初篩

2.3.1 菌株耐酸性試驗 乳酸菌耐低酸特性是其發揮抗氧化作用的重要前提[17]。對分離得到的61株乳酸菌進行耐酸性試驗，篩選出耐酸性能較好的16株乳酸菌，這16株乳酸菌在不同酸性條件下的生長情況見表2。

表2 初始 pH 對菌株生長的影響?

由表2可知，當培養基初始pH為5.0和6.0時，菌株OD值均較高，表示pH 5.0～6.0的培養基環境適宜菌株生長。其中E1和C19在pH 6.0時活性最高，OD600 nm分別為2.62和2.59。pH為5.0時，E1和C19的OD600 nm分別為2.48和2.46，活性仍然高于其他菌株。pH為4.0時，16株乳酸菌活性顯著降低，OD600 nm均在0.96以上，其中A1、C19和E1活性較好，OD600 nm均在1.90以上。pH為3.0時，雖然其生長活性受到了抑制，但16株乳酸菌仍然可以生長，pH為2.0時，全部菌株無法正常生長。經過耐酸性試驗篩選后發現：從西藏牦牛酥油中分離得到的61株乳酸菌中，有16株對低酸環境具有較好的耐受性，可進入下一階段試驗。

2.3.2 菌株耐過氧化氫試驗 對上述16株乳酸菌進行不同H2O2濃度的耐受性試驗，篩選得到7株H2O2耐受能力較好的乳酸菌，這7株乳酸菌在不同H2O2濃度下的生長情況見表3。

表3 過氧化氫對菌株生長的影響?

由表3可知，H2O2濃度變化對乳酸菌的生長產生顯著性影響。當H2O2濃度為3 mmol/L時，7株乳酸菌均無法正常生長。當H2O2濃度為2 mmol/L時，5株乳酸菌生長情況較優，OD600 nm平均值為1.90，其中A1生長情況最好，OD600 nm為2.04。當H2O2濃度為0，1 mmol/L時，乳酸菌生長情況普遍較好且差異不顯著，7株乳酸菌OD600 nm平均值分別為2.29，2.20。經過耐H2O2試驗篩選后，發現從西藏牦牛酥油中分離得到的16株耐低酸的乳酸菌中有7株對H2O2有較好的耐受性。對這7株乳酸菌的抗氧化性能進行研究，以期找到具有較好抗氧化性能的乳酸菌，為乳酸菌天然抗氧化發酵劑的研究提供基礎。

2.4 菌株抗氧化試驗復篩

2.4.1 清除DPPH自由基能力 由圖4可知，大多數乳酸菌的完整細胞組的DPPH自由基清除率大于無細胞提取物組，但也有部分乳酸菌的無細胞提取物組的DPPH自由基清除率反而更高。說明每株乳酸菌完整細胞組和無細胞提取物組的DPPH自由基清除率無對應關系，即受試乳酸菌清除DPPH自由基的活性物質存在于細胞的不同部位。完整細胞組的DPPH清除率平均達到15.59%，其中A1和C19兩株乳酸菌DPPH自由基清除率較高，均為18.68%。無細胞提取物組的DPPH自由基清除率平均為16.18%，雖然平均值低于完整細胞組，但是C19的清除率最高為30.84%。吳石金等[12]分離得到的34株乳酸菌其DPPH自由基清除率最高不超過30%。針對DPPH自由基清除率對7株乳酸菌進行篩選，C19表現最優。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4.2 清除OH自由基能力 由圖5可知，與乳酸菌DPPH自由基清除率表現相似，菌株完整細胞組和無細胞提取物組的OH自由基清除率無對應關系，即說明受試乳酸菌清除OH自由基的活性物質存在于細胞的不同部位，而非僅存在于細胞內或細胞外。7株乳酸菌完整細胞組和無細胞提取物組OH自由基清除率之間差異顯著。完整細胞組平均清除率達到28.71%，其中E1的自由基清除率最高為47.87%，A1的自由基清除率最低僅為8.08%。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

無細胞提取物組的自由基平均清除率為33.87%，其中E1的清除率最高為57.60%，C19的OH自由基清除率最低僅為11.46%。7株乳酸菌中E1的清除率最高為57.60%。劉亞東等[18]對從西藏曲拉、發酵乳中分離得到的23株乳酸菌OH自由基清除率進行測定，最高僅有27.62%，遠低于試驗所得菌株。Ding等[19]對從青藏高原牛乳中分離得到的菌株進行OH自由基清除率檢測，最高為59.00%，相較之下，試驗篩選得到的乳酸菌OH自由基清除率略低。針對OH自由基清除率對7株乳酸菌進行篩選，E1表現最優。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.4.3 清除超氧陰離子自由基能力 由圖6可知，受試乳酸菌清除超氧陰離子自由基的活性物質存在于細胞的不同部位。7株乳酸菌完整細胞組和無細胞提取物組的超氧陰離子清除率差異顯著。完整細胞組超氧陰離子自由基平均清除率達到20.57%，其中C19的超氧陰離子的清除率最高為24.59%。無細胞提取物組的超氧陰離子自由平均清除率達到22.50%，其中C19的超氧陰離子的清除率最高為26.91%。劉珊春等[20]對18株乳酸菌的超氧陰離子自由基清除率進行測定，最高為28.78%。相較之下，試驗篩選得到的乳酸菌雖然超氧陰離子自由基清除率略低。針對超氧陰離子自由基清除率對7株乳酸菌進行篩選，C19表現最優。

3 結論

對采集自西藏不同海拔的牦牛酥油進行菌株分離，共得到61株菌株，經分子生物學鑒定分別為：副干酪乳桿菌亞種(L.paracaseisubsp.tolerans) 9株；副干酪乳桿菌(L.paracasei) 26株；植物乳桿菌(L.plantarum) 21株；德氏乳桿菌(L.delbrueckii) 3株；鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus) 2株。

通過乳酸菌耐受性試驗得到7株既耐低酸環境又對H2O2具有較好耐受性的乳酸菌，分別為A1、A4、B1、C1、C2、C19、E1。對7株乳酸菌的抗氧化性能分析發現，菌株的DPPH自由基、OH自由基和超氧陰離子自由基清除率無對應關系。C19的DPPH自由基清除力和超氧陰離子自由基清除力最優，分別為30.84%和26.91%，E1的OH自由基清除力最優，為57.60%。此外，C19和E1兩株乳酸菌分別來自拉薩市當雄縣[海拔(4 250±50) m]和拉薩市堆龍德慶區[海拔(3 790±50) m]的酥油樣品中，研究發現，并非海拔越高乳酸菌的抗氧化活性越強。試驗得到的C19(L.plantarum)和E1(L.rhamnosus)兩株乳酸菌具備天然抗氧化發酵劑的開發潛力。