油菜蜂花粉蛋白酶法破壁提取及結構表征

王凌波 朱 松 陳尚衛

(1. 江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

蜂花粉是花粉與蜜蜂分泌物的混合體，含有豐富的蛋白質、多肽、氨基酸、酚類物質、活性多糖、不飽和脂肪酸和微量活性元素[1-2]，有“完全營養食品”之稱[3]。中國每年蜂群采集的花粉量可達20萬t，但實際利用的花粉只有6 000 t左右，且以簡單殺菌的粗制品為主[4]。

高血壓是一種常見的心血管疾病，是危害中老年人健康的頭號殺手[5]，目前治療高血壓的藥物基本為化學合成藥物，均存在一定的副作用[6]。隨著生活水平的提高，人們更注重藥物和保健品的安全性，食源性產品受到愈來愈多的關注。近年來，有研究者[7-10]發現以蜂花粉為原料開發所得的ACE抑制肽具有降高血壓作用。

蜂花粉的細胞壁由內壁和外壁兩部分組成。外壁厚而硬，具有特殊的雕刻型花紋圖案，主要成分為孢粉素，此外還含有纖維素、生物類黃酮、脂類物質及蛋白質等物質。由于孢粉素是極其穩定的生物聚合物，因此外壁具有耐酸、耐堿、耐腐蝕的特點。內壁的主要成分為纖維素、果膠質、半纖維素及蛋白質，其上有萌發孔，是物質交換的通道，一般條件下萌發孔呈閉鎖狀態。細胞壁的外壁和內壁會阻礙胞內營養物質的溶出，因此采用破壁處理來提高蛋白的提取率。常見破壁方式有溫差—超聲復合法[11]、酶解法、超聲酶解法[12]、超臨界二氧化碳破壁法[13]等。酶法或復合超聲酶解法相比其他常見破壁方法，操作更簡便快速，能更好保留蜂花粉的活性成分[14]。目前所報道的文獻[15-17]多以破壁率、蛋白分散指數來評價破壁效果，此外可溶性糖含量、粒度分析[18]等也可作為評價指標。由于試驗的目的是為了促進蜂花粉蛋白的溶出，相比其他破壁指標，以蛋白提取率為評價指標更直觀可靠。因此試驗擬以蛋白提取率為指標對蜂花粉水溶性蛋白的酶法破壁提取工藝進行優化，并對蜂花粉蛋白進行純化表征，以期為后續蜂花粉ACE抑制肽的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

油菜蜂花粉：江蘇日高峰產品有限公司；

Viscozyme L復合植物水解酶：100 FBG/g，諾維信生物技術有限公司；

其余試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

冷凍干燥機：SCIENTZ-10N型，寧波新芝生物科技有限公司；

定氮儀：KDN103F型，上海纖檢儀器有限公司；

掃描電鏡：QUANTA 200型，荷蘭FEI公司；

臺式低速離心機：TD6型，湖南赫西儀器裝備有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：NEXUS 670型，美國尼高力公司。

1.2 方法

1.2.1 蜂花粉蛋白酶解提取方法的選擇 取2.5 g研磨后的蜂花粉，加入50 mL pH 6.5的水溶液。振蕩酶解法是在混合液中加入體積分數2% 100 FBG/g的復合植物水解酶后，40 ℃下振蕩8 h；振蕩酶解超聲法是在混合液中加入體積分數2% 100 FBG/g復合植物水解酶后，先于40 ℃下振蕩4 h，再在頻率40 kHz，功率250 W條件下超聲處理4 h。每個試驗組在8 h后以4 000 r/min的轉速離心20 min，取5 mL上清液，測定其蛋白質含量，按式(1) 計算蛋白提取率。各組離心后所得沉淀用3 500 Da 透析袋除糖后，濃縮凍干，進行電鏡表征及氨基酸組成、紅外光譜、圓二色譜分析。

(1)

式中：

c——蛋白提取率，%；

m1——所取上清液中蛋白含量，mg；

m2——蜂花粉蛋白含量，mg；

V——上清液總體積，mL。

1.2.2 蜂花粉蛋白酶解提取單因素試驗 根據1.2.1結果確定提取方法后，以蛋白提取率為評價指標，進行單因素優化試驗。固定水溶液pH值為6.5、酶解溫度42 ℃、酶解時間6 h，考察加酶量(體積分數0.04%，0.10%，0.20%，0.40%，1.00%)對蛋白提取率的影響；固定加酶量為體積分數0.40%、酶解溫度42 ℃、酶解時間6 h，考察提取液pH(3，4，5，6，7，8)對蛋白提取率的影響；固定加酶量為體積分數0.40%、水溶液pH值為6.5、酶解時間6 h，考察酶解溫度(30，40，50，60，70 ℃)對蛋白提取率的影響；固定加酶量為體積分數0.40%、水溶液pH值為6.5、酶解溫度42 ℃，考察酶解時間(3.0，4.5，6.0，8.0，10.0 h)對蛋白提取率的影響。

1.2.3 響應面優化蜂花粉蛋白提取條件 根據單因素試驗結果，選擇對蛋白提取率影響較大的3個因素，以蛋白提取率為響應值，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理進行三因素三水平的響應面分析試驗。

1.2.4 蜂花粉基本成分分析

(1) 水分的測定：參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》中的直接干燥法。

(2) 灰分的測定：參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》中的第一法。

(3) 蛋白質的測定：參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法。

(4) 脂肪的測定：參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法。

1.2.5 蜂花粉水溶性蛋白的純化和表征 將15 g蜂花粉原料經優化酶解破壁、冷凍干燥后，加入至5 mL pH 6的PBS緩沖液中溶解，吸取2 mL上述溶液加入至已填充平衡完畢的Sephadex G-100凝膠柱中。用pH 6的PBS緩沖液洗脫，流速為1 mL/min，用部分收集器收集。將所得峰組分置于3 000 Da透析袋中透析48 h。透析完成后對各組分分別進行冷凍干燥，最后用凱氏定氮法測定樣品中蛋白質量，用OPA衍生化—高效液相法[19]測定水解氨基酸含量，并對蛋白進行圓二色譜[20]和傅里葉紅外光譜分析[21]。

1.2.6 數據分析 采用Origin 2016軟件處理數據并繪圖，采用Design Expert 8.0軟件進行響應面優化分析，采用SPSS 19.0進行方差與顯著性分析(P<0.05)，采用Chirascan軟件對圓二色譜圖進行數據處理。所有試驗重復3次，取其平均值，并計算標準偏差。

2 結果與分析

2.1 蜂花粉基本成分分析

蜂花粉的組成成分受植物來源、氣候、環境等多種因素的影響[22]。試驗所用蜂花粉原料的水分、灰分、脂肪、蛋白含量如表1所示。結果與Ares等[23]和Yang等[24]的報道基本相符。

表1 蜂花粉基礎指標含量

2.2 蜂花粉蛋白酶解提取方法的選擇

蜂花粉的細胞壁由內壁和外壁兩部分組成。外壁較為堅硬，主要由孢粉素、纖維素和蛋白質等物質組成，呈特殊雕紋，其中孢粉素耐壓、耐酸堿，不易被分解。內壁的主要成分為纖維素、果膠質、半纖維素及蛋白質，其上有萌發孔，是物質交換的通道，一般條件下萌發孔呈閉鎖狀態。

如圖1(a)所示，酶解處理后的雕紋狀的蜂花粉細胞外壁幾乎已經完全脫落，細胞內壁被破壞，產生細胞碎片。如圖1(b)所示，經振蕩酶解超聲處理后，蜂花粉的細胞外壁和內壁也被破壞，但破壞程度弱于振蕩酶解。振蕩酶解的蛋白質提取率為(51.80±1.01)%，振蕩酶解后超聲法的蛋白提取率為(48.60±0.67)%，與圖1所示的試驗結果相吻合。這可能是由于頻率40 kHz，功率250 W，時間4 h的超聲條件影響了復合植物水解酶的活性。一般低強度的超聲能使酶活增強，超聲效應會導致媒介局部壓力和溫度的急劇升高，蛋白質發生折疊化的可能性增強，折疊化的蛋白質會暴露更多的基團，從而其和酶的親和力增強[25]。比如Nguyen等[26]發現，纖維素酶在經過頻率20 kHz，密度6 W/L，時間60 s的超聲處理后，其酶活提高了18.7%。但是當超聲強度過大、超聲時間過長時，酶的構象會因超聲處理而改變，從而影響酶的活性。試驗所用的超聲條件可能降低了復合植物水解酶的活性，因此蛋白質提取率低于振蕩酶解。

圖1 不同提取方法的電鏡表征

2.3 蜂花粉蛋白提取條件的優化

2.3.1 建立回歸模型及方差分析 根據單因素結果，確定如表2所示的因素水平表，試驗設計及結果見表3。

表2 響應面試驗因素水平設計

表3 試驗設計與結果

采用Design Expert 8.0軟件對表3試驗數據進行回歸分析，得到蛋白提取率與振蕩酶解各因素變量的二次模擬方程：

Y=77.47-0.13A-0.81B+1.41C+0.095AB+0.015AC-0.75BC-2.52A2-1.00B2-0.97C2。

(2)

對表3中的試驗結果進行統計分析，方差分析結果如表4所示。

由表4可知，該模型P=0.000 5<0.01(極顯著)，失擬項P=0.180 9>0.05(不顯著)，表明該回歸模型與試驗數據很吻合，試驗誤差較小，模型選擇正確。B、C的一次項均達到極顯著水平，表明酶解溫度、酶解時間對蛋白提取率有顯著影響，影響效果為酶解時間>酶解溫度。A的一次項未達到顯著水平，表明當水溶液的pH值為5～7時，對蛋白提取率的影響不顯著。交互項中BC項P值<0.05，二次項A2、B2、C2對蛋白提取的曲面效應顯著，表明各因素對蛋白提取的影響不是簡單的線性關系。

表4 方差分析

2.3.2 響應面分析 作出響應面圖，分析水溶液pH值、酶解溫度、酶解時間對蛋白提取率的影響情況，結果如圖2所示。

圖2 蛋白提取率響應曲面圖

由圖2可知，水溶液的pH和酶解溫度、酶解時間的交互作用顯著，而酶解溫度和酶解時間的交互作用較小。

2.3.3 最優工藝組合的確定及驗證 通過Design Expert 8.0軟件分析對回歸方程進行優化擬合得，振蕩酶解提取蜂花粉蛋白的最佳條件為：水溶液pH 5.96，酶解溫度42.14 ℃，酶解時間6.50 h，該條件下蛋白提取率的預測值為78.53%。為檢驗該結果的可靠性，進行3次重復驗證實驗，因試驗設備條件限制，設置條件為：水溶液pH 5.96，酶解溫度42.0 ℃，酶解時間6.5 h，得到蜂花粉蛋白提取率平均值為79.53%。

2.4 蜂花粉蛋白的純化和表征

2.4.1 蜂花粉蛋白的純化 試驗選擇的Sephadex G-100凝膠柱可用來分離4～150 kDa范圍內的蛋白質。蜂花粉提取液通過Sephadex G-100后共得到如圖3所示的4個不同的組分峰，經凱氏定氮法測定只有峰1中含有蛋白質，其蛋白含量為(66.77±2.11)%。

圖3 蜂花粉蛋白Sephadex G-100凝膠層析分離圖

2.4.2 蜂花粉蛋白的表征 如表5所示，蜂花粉蛋白的水解總氨基酸含量為63.49 g/100 g，其中疏水性氨基酸含量為27.52 g/100 g，占總氨基酸含量的43.35%；芳香族氨基酸Tyr、Trp和Phe三者的總含量為8.98 g/100 g。

表5 水解氨基酸含量

Sarmadi等[27]研究表明疏水性氨基酸可以增強肽和脂類物質的相互作用，使活性肽更易進入靶器官或目標位點，從而增強肽的生物活性。芳香族氨基酸能通過提供多余電子來提高肽的生物活性。此外根據文獻[28]可知，C末端連有疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的肽結合ACE的活性強。因此，具有較高疏水性氨基酸含量和芳香族氨基酸含量的蜂花粉蛋白是制備功能性低聚肽的良好材料[29]。

如圖4所示，蜂花粉蛋白在3 500 cm-1附近出現吸收峰，是由N—H的振動引起的，吸收峰的個數只有一個，因此可能為仲胺、仲酰胺或酰亞胺，考慮到蛋白質的肽鍵是一種酰胺鍵，并且此峰為尖銳強吸收峰，所以此蜂花粉蛋白可能含有較多的仲酰胺。1 450，1 600 cm-1處的吸收峰為芳環特征峰，與表5所得結果相同，說明此蛋白中存在芳香族氨基酸。

圖4 蜂花粉蛋白的紅外光譜圖

圖5 蜂花粉蛋白的圓二色譜圖

表6 蜂花粉蛋白的圓二色譜數據處理結果

利用Chirascan軟件對圓二色譜圖(圖5)進行數據分析結果(表6)表明，α螺旋、β折疊結構具有一定的剛性，是二級結構中的有序結構。β轉角和無規則卷曲結構沒有剛性，其兩者含量越高，代表蛋白分子的有序性越弱[30]，蛋白更易被水解。此蜂花粉蛋白中β轉角和無規則卷曲結構占到54.2%，說明其有序性較弱，易被蛋白酶酶解。

3 結論

通過單因素試驗和響應面優化試驗，確定油菜蜂花粉提取的最佳條件為：將2.5 g峰花粉和50 mL pH 5.96的水溶液混合后，加入體積分數0.4%的復合植物水解酶(100 FBG/g)，42 ℃振蕩酶解6.5 h，此條件下蛋白提取率為79.53%。通過Sephadex G-100凝膠層析法對蜂花粉水溶性蛋白進行純化，其氨基酸組成、紅外譜圖和圓二譜圖結果表明油菜蜂花粉蛋白的有序性較弱，易被酶解，并且含有較高含量的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸，是制備ACE抑制肽的良好原料。后續將對ACE抑制肽的制備及分離純化進行研究，以獲得來源于油菜蜂花粉蛋白的高活性ACE抑制肽。