提取方法對荷葉多糖得率及抗氧化活性的影響

邢 穎 景艷芳

(運城學院生命科學系，山西 運城 044000)

荷葉為睡蓮科水生植物蓮(Nelumbonucifera)的葉片，又被稱為蓮葉、藕葉，是中國傳統的藥食同源植物[1-2]。荷葉中含有多種生物活性成分，如多酚、類黃酮、多糖及生物堿等[3]。研究[4]表明，植物多糖對人體具有多種功能，如抗腫瘤、增強免疫力、調節血糖血脂、抗輻射等。

多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酸堿提取法、超聲波輔助法、微波提取法、酶法輔助提取、超高壓及超臨界萃取法等[5]。汪瑞敏等[6]對比了熱水、微波、超聲、微波結合超聲4種提取方式對天麻多糖含量及抗氧化活性的影響，洪軍等[7]對比了熱水、超聲波及微波對禹州漏蘆多糖提取率、抗菌及抗氧化的影響。而不同提取方法對荷葉多糖的影響尚未見報道。試驗擬采用熱水法、堿法、超聲波法及酶法4種提取方式對荷葉多糖進行提取純化，并以DPPH·、ABTS+·、·OH及還原力為指標分析荷葉粗多糖的抗氧化活性，旨在為荷葉多糖的加工利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

干荷葉：60 ℃烘至恒重，粉碎后過0.25 mm篩，4 ℃密封保存備用，市售；

無水乙醇、三氯甲烷、乙醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、過硫酸鉀、葡萄糖、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、溴化鉀：分析純，天津大茂化學試劑廠；

纖維素酶：≥30 U/mg，西隴化工有限公司；

VC：分析純，西隴化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

數控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

循環水真空泵：SHZ-DⅢ型，鄭州英峪予華儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-5200型，上海元析儀器有限公司；

pH計：PHS-3C型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

離心沉淀機：LXJ-Ⅱ型，上海醫分儀器制造有限公司；

粉末壓片機：769YP-15A型，天津市科器高新技術公司；

傅立葉紅外光譜分析儀：NICOLET380型，天津天光光學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 荷葉多糖的提取

(1) 超聲波法：稱取一定量荷葉粉，加入20倍量蒸餾水，超聲功率400 W，提取時間40 min，提取兩次，抽濾，合并提取液。

(2) 熱水法：稱取一定量荷葉粉，加入20倍量蒸餾水，90 ℃水浴提取兩次，每次2 h，抽濾，合并提取液。

(3) 酶法：稱取一定量荷葉粉，按固液比1∶15(g/mL)加入蒸餾水，加入0.1 g纖維素酶，用緩沖溶液調節pH為4.5，50 ℃恒溫震蕩1 h，提取兩次，抽濾，合并提取液。

(4) 堿法：稱取一定量荷葉粉，按固液比1∶20(g/mL)加入1.2 mol/L氫氧化鈉溶液，60 ℃提取2 h，提取兩次，抽濾，合并提取液。

1.2.2 荷葉多糖的純化 采用Sevag脫蛋白、醇沉靜置過夜，3 500 r/min離心20 min，取杯底沉淀冷凍干燥，即荷葉粗多糖。

1.2.3 多糖含量測定 采用苯酚—硫酸法[8]。稱取10 mg粗多糖定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的粗多糖溶液。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為Y=0.615X+0.028 9，R2=0.995 7，并按式(1)計算多糖得率。

(1)

式中：

Y——多糖得率，mg/g；

C——荷葉粗多糖配制液中多糖濃度，mg/mL；

V——配制液體積，mL；

M——荷葉質量，g。

1.2.4 紅外光譜表征 取粗多糖1 mg進行溴化鉀壓片，掃描范圍400～4 000 cm-1，掃描次數15～16次。

1.2.5 抗氧化活性測定

(1) DPPH·清除能力：參照文獻[9]并修改。取不同濃度的多糖溶液2 mL，加入0.1 mmol/L DPPH無水乙醇溶液4 mL，搖勻，避光反應1 h，測定517 nm處吸光度值。以蒸餾水作空白對照，VC作陽性對照，并按式(2)計算DPPH·清除率。

(2)

式中：

S1——自由基清除率，%；

A0——空白組吸光度；

A——樣品吸光度。

(2) ABTS+·清除能力：參照文獻[10]并修改。取7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液各0.2 mL，混勻，暗處反應12～16 h形成ABTS+·母液，用無水乙醇稀釋至A734 nm為0.68～0.72。取多糖溶液0.8 mL，加入ABTS+·溶液3.2 mL，搖勻，避光反應10 min，測定734 nm處吸光度值，以無水乙醇作空白對照，VC作陽性對照，并按式(2)計算ABTS+·清除率。

(3) ·OH清除能力：參照文獻[11]并修改。取1 mL多糖溶液，加入9 mmol/L乙醇—水楊酸溶液、9 mmol/L FeSO2溶液、8.8 mmol/L H2O2溶液及蒸餾水各1 mL，搖勻，37 ℃水浴30 min，冷卻，測定吸光度值。用蒸餾水代替樣液作空白對照，蒸餾水代替H2O2溶液作樣品對照，VC作陽性對照，按式(3)計算·OH清除率。

(3)

式中：

S2——·OH清除率，%；

A0——空白對照組吸光度；

Ax——樣品吸光度；

Ax0——樣品對照組吸光度。

(4) 還原力：參照文獻[12]并修改。取1 mL多糖溶液，依次加入2 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%鐵氰化鉀溶液，搖勻，50 ℃水浴20 min，冷卻，加入2 mL 10% TCA溶液、2 mL蒸餾水、0.4 mL 0.1% FeCl3溶液，搖勻，50 ℃保溫10 min，測定700 nm處吸光度值，以VC作陽性對照，蒸餾水作空白對照。

1.2.6 數據處理 試驗數據均為3次重復的平均值，表示為“平均值±標準偏差”，采用SPSS 15.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 多糖得率比較

由圖1可知，不同提取方法對多糖得率影響差異顯著(P<0.05)，其中超聲波法的得率最高，為14.11 mg/g，其次為酶法和熱水法。超聲波作用過程中其空化作用、機械作用可加速荷葉細胞壁的破碎，有利于胞內物質的釋放，提高多糖浸出率，且超聲波法相比于其他提取方式明顯節約時間[13-14]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 紅外光譜分析

圖2 荷葉多糖紅外光譜圖

2.3 抗氧化活性比較

2.3.1 DPPH·清除能力 由圖3可知，4種荷葉粗多糖濃度在0.013～0.520 mg/mL范圍內對DPPH·有一定的清除能力，且隨多糖濃度的增大而增強，并呈明顯的劑量依賴性，其清除率大小依次為熱水法>超聲波法>堿法>酶法。當樣液濃度為0.013 mg/mL時，熱水法提取的多糖對DPPH·的清除率為VC的0.23倍，而酶法提取的僅為VC的0.03倍。

圖3 粗多糖的DPPH·清除能力

2.3.2 ABTS+·清除能力 由圖4可知，4種荷葉多糖對ABTS+·有一定的清除能力，且隨多糖濃度的升高依次增大，并呈劑量依賴關系，其清除能力依次為熱水法>超聲波法>堿法>酶法，當多糖濃度為0.52 mg/mL時，其清除率分別為85.9%，87.9%，79.4%，76.5%，均低于VC的。

圖4 粗多糖的ABTS+·清除能力

2.3.3 ·OH清除能力 由圖5可知，4種荷葉多糖對·OH的清除能力隨多糖濃度的增加而增加，并呈劑量依賴關系，但遠不如VC的。當多糖濃度為16 mg/mL時，熱水法、超聲波法、酶法及堿法提取粗多糖的清除率分別為30.22%，27.90%，26.20%，25.80%。

圖5 粗多糖的·OH清除能力

2.3.4 還原力 由圖6可知，4種荷葉粗多糖均具有一定的還原力，且隨濃度的增大而增強，但相比于VC，其還原力較弱。當多糖濃度為8 mg/mL時，熱水法和堿法的A700 nm達2.91，2.89，而超聲波法和酶法的A700 nm僅為0.93，0.81。

圖6 粗多糖的還原力

3 結論

試驗表明，超聲波法、酶法、熱水法及堿法4種提取方式的多糖得率依次為14.11，11.83，11.60，8.19 mg/g，且紅外光譜相似，均具有典型多糖的特征吸收峰。當濃度為0.013～0.520 mg/mL時，4種粗多糖對DPPH·和ABTS+· 具有顯著的抗氧化活性；當濃度為0.39～8.00 mg/mL 時，4種粗多糖對還原力和·OH的清除效果較好，且清除率與多糖濃度呈正相關，其中熱水法和超聲波法的抗氧化活性較好，但均低于VC的。綜上，超聲波法的多糖得率最高，抗氧化活性較強，提取時間最短。后續可對荷葉多糖的單糖組成及活性進行研究。