正山小種精油大孔樹脂吸附工藝優化及其抗氧化活性分析

何理琴 王彩楠 劉志彬 張 晨 張 雯 倪 莉

(1. 福州大學食品科學技術研究所，福建 福州 350108；2. 福建省食品生物技術創新工程技術研究中心，福建 福州 350108)

產自福建北部武夷山的正山小種是紅茶的典型代表，具有濃郁的香氣和豐富的滋味。目前對正山小種揮發性香氣成分的研究已有多篇報道。例如，郭雯飛等[1]運用GC-MS對正山小種的香氣組成進行探究，結果表明長葉烯、香葉醇、反式-2己烯醛、苯乙醛、α-萜品醇等是正山小種的主要成分。李健權[2]采用同時蒸餾萃取法提取不同產地的正山小種的香氣成分，對其分析結果表明正山小種中醛類和醇類含量相差不大，其中香葉醇、3-甲基-丁醛、芳樟醇、2-甲基-丁醛、己醛以及水楊酸甲酯含量較高，是正山小種特征性香氣成分。廉明等[3]對中國4種名優紅茶揮發性成分進行分析，研究顯示植醇、香葉醇、β-紫羅酮、二氫獼猴桃內酯、咖啡因和芳樟醇氧化物是正山小種的主要成分。以正山小種茶葉，或其加工下腳料為原料，濃縮富集這些正山小種的香氣成分，將其制備成香氣精油產品可擴大其使用范圍，提高其使用效率及經濟附加值，具備一定的市場潛力，但正山小種精油的開發目前還未見報道。

研究擬以正山小種作為原料，使用蒸餾法制備正山小種香氣水，然后通過大孔樹脂吸附其香氣成分，之后使用乙醇進行解吸附，制備正山小種精油，最后使用GC-MS分析其揮發性香氣成分，并評估產品的抗氧化活性。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

正山小種：產地武夷山；

正構烷烴C7～C40：美國O2si Smart Solutions公司；

2-辛醇：98.0%，德國Dr.Ehrensorfer公司；

二苯代苦味酰基自由基(DPPH)和2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)：上海源葉生物科技有限公司；

其他試劑：分析純。

1.2 儀器與設備

集熱式磁力攪拌器：DF-1型，金壇市鑫諾實驗儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV-2000型，日本HITACHI公司；

氣相色譜儀：7890B型，美國安捷倫公司；

質譜儀：5977A型，美國安捷倫公司；

電子天平：BL150型，德國賽多利斯公司；

固相微萃取萃取頭：50/30 μm DVB/CAR/PDMS型，美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 正山小種香氣水的制備和大孔樹脂的預處理 取100 g的正山小種茶葉，浸沒于1 000 mL 沸水(95 ℃)2 min，然后用兩層紗布過濾去除茶葉茶渣得到正山小種茶湯。茶湯冷卻至室溫后在55 ℃水浴上進行減壓蒸餾(壓力5 kPa)，收集冷凝液(約600 mL)，作為正山小種香氣水，進一步使用大孔樹脂吸附其香氣成分。

經前期試驗探索發現LX-8大孔樹脂對正山小種香氣成分具有較強的吸附及解吸附能力，因此選取LX-8大孔樹脂用以制備正山小種香精。取150 mg LX-8大孔樹脂置于燒杯中，加入300 mL 95%乙醇浸泡24 h使樹脂充分溶脹。將充分溶脹的樹脂材料裝填于玻璃柱，并用2倍柱體積的乙醇(95%)清洗。然后用5%鹽酸溶液浸泡6 h，再用蒸餾水清洗直至流出液pH呈中性，之后用5%氫氧化鈉溶液浸泡6 h，再用蒸餾水清洗直至流出液pH呈中性。最后去除預處理好的大孔樹脂材料備用。

1.3.2 正山小種精油的制備和香氣成分含量的測定 使用大孔樹脂靜態吸附法制備正山小種香精。稱取一定量經預處理好的樹脂材料放入錐形瓶中，再分別加入一定體積上述制備好的香氣水溶液，密封瓶口，置于25 ℃轉速為200 r/min的恒溫搖床振蕩器中，振蕩吸附一定時間，收集吸附液。

使用吸光值法粗略測定樣品的香氣成分含量。在波長200～380 nm范圍內掃描樣品的吸光值，并計算其積分，用以代表溶液中揮發性香氣成分的濃度，并按式(1)和式(2)分別計算樹脂的吸附率和吸附量。

(1)

(2)

式中：

A——吸附率，%；

S0——原液吸光值積分；

S1——吸附液吸光值積分；

Q——樹脂吸附量，mL/g；

V——香氣水體積，mL；

M——樹脂干重，g。

1.3.3 正山小種揮發性香氣成分的分析 使用頂空固相微萃取(HS-SPME)結合GC-MS技術分析正山小種精油各個制備階段的樣品[4]。樣品的前處理和分析方法：量取5.9 mL樣品于15 mL樣品瓶中，加入2 g NaCl和100 μL 2-辛醇(內標濃度0.062 5 mL/L)，并將萃取頭插入到樣品瓶的頂空部分，立即置于50 ℃水浴中平衡10 min，之后推出纖維頭進行頂空吸附，萃取時間為40 min。之后使用GC-MS分析樣品。色譜條件：色譜柱HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm)；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升溫至90 ℃，再以3 ℃/min升溫至180 ℃；進樣口溫度250 ℃；分流進樣，分流比20∶1；溶劑延遲時間3 min；載氣是He(99.999%)。質譜條件：離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描模式：全掃描；質量掃描范圍m/z30～550。揮發性物質的鑒定結果以NIST11譜庫檢索和保留指數共同鑒定[5]。

1.3.4 正山小種精油ABTS自由基清除率的測定 配制7 mmol/L的ABTS貯存母液及2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液，臨用前以1∶1的體積比混合，室溫避光放置16 h 后，用5 mmol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液稀釋至于734 nm處吸光值為0.70±0.02，即ABTS自由基溶液。ABTS自由基溶液與不同濃度的樣品以1∶1 (體積比)混合，室溫避光反應10 min后，于734 nm下測定吸光值，磷酸鹽緩沖液(5 mmol/L，pH 7.4)調零?？瞻捉M用95%酒精代替樣品。按式(3)計算ABTS自由基清除率[6]。

(3)

式中：

SRABTS——ABTS自由基清除率，%；

A——空白組吸光值；

B——樣品組吸光值。

1.3.5 正山小種精油DPPH自由基清除率的測定 分別取1.5 mL不同濃度樣品溶液與1.5 mL DPPH溶液(0.02 mmol/L，95%乙醇配制)充分混勻，室溫避光反應30 min于517 nm處測定其吸光值；樣品參比組為1.5 mL 不同濃度的香精溶液與1.5 mL 95%乙醇溶液；空白組為1.5 mL DPPH溶液與1.5 mL 95%乙醇溶液。按式(4)計算DPPH自由基清除率[6]。

(4)

式中：

SRDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A——樣品組吸光值；

B——樣品參比組吸光值；

C——空白組吸光值。

1.3.6 數據分析 試驗數據采用平均值±標準差表示，并使用SPSS 22.0統計分析軟件中的Duncan's ANOVE(P<0.05)對試驗數據進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 大孔樹脂吸附法制備正山小種精油工藝優化

使用蒸餾法制備正山小種香氣水后，利用大孔樹脂吸附正山小種香氣成分，并通過乙醇洗脫制備正山小種精油。前期試驗對比了12種大孔樹脂(HPD722、DM-130、AB-8、D101、HZ816、LSA-40、DM301、HPD750、LSA-8、LX-8、HPD100、HPD950)對正山小種香氣水的吸附量和解吸附量，發現LX-8大孔樹脂對正山小種香氣成分具有較強的吸附及解析附能力，因此選取LX-8大孔樹脂用以制備正山小種香精。進一步對LX-8大孔樹脂的使用量，吸附時間以及乙醇洗脫時間進行優化。大孔樹脂對正山小種香氣成分吸附和解吸附的效果使用吸光值法進行粗略判斷，試驗結果如下。

2.1.1 LX-8大孔樹脂使用量的優化 對比不同LX-8大孔樹脂的使用量在恒溫搖床振蕩器(25 ℃，轉速200 r/min)中吸附3 h對350 mL正山小種香氣水的吸附效果，試驗結果如圖1所示。

圖1 LX-8大孔樹脂不同使用量對香氣成分吸附率的影響

由圖1可知：大孔樹脂對香氣成分的吸附率隨樹脂使用量的增加而逐漸升高，在樹脂含量提高到1.0 g以后吸附量趨于平緩。綜合考慮大孔樹脂的使用量和香氣成分的吸附率，選取1.0 g LX-8大孔樹脂處理350 mL正山小種香氣水。該使用量下，大孔樹脂對正山小種香氣成分的吸附率為77.3%。

2.1.2 LX-8大孔樹脂吸附時間的優化 取1.0 g LX-8大孔樹脂在恒溫搖床振蕩器(25 ℃，轉速200 r/min)中對350 mL正山小種香氣水進行吸附，對比不同吸附時間下大孔樹脂對香氣成分的吸附量，試驗結果如圖2所示。

由圖2可知：LX-8大孔樹脂對香氣成分的吸附量隨吸附時間的增加而增加，吸附150 min前，LX-8大孔樹脂吸附量迅速增加，之后趨緩。吸附180 min后基本達到吸附平衡，綜合考慮大孔樹脂對香氣成分的吸附量，選取180 min作為LX-8大孔樹脂的最佳吸附時間。

圖2 LX-8大孔樹脂不同吸附時間對香氣成分吸附量的影響

2.1.3 LX-8大孔樹脂正山小種香氣解吸附時間與次數的優化 將1.0 g充分吸附后的大孔樹脂通過抽濾法去除吸附液，并用蒸餾水洗滌3次，然后加入5 mL 95%乙醇在恒溫搖床振蕩器(25 ℃，轉速200 r/min)震蕩對香氣成分進行解吸附，對比不同解吸附時間對正山小種香氣成分的解吸附效果，結果見圖3。

圖3 不同解吸附時間對香氣成分解吸附效果的影響

由圖3可知：當解吸附時間為150 min時獲得最高香氣成分濃度的正山小種香精，提高吸附時間無法進一步獲得更高濃度的香精產品。因此選取150 min作為LX-8大孔樹脂的最佳解吸附時間。解吸附條件為：1.0 g LX-8已吸附香氣成分的大孔樹脂使用5 mL 95%乙醇在恒溫搖床振蕩器(25 ℃，轉速200 r/min)震蕩解吸附150 min。該解吸附條件下獲得的正山小種香精香氣成分濃度是香氣水香氣成分濃度的約35倍，香氣成分的回收率約51%。

2.2 GC-MS分析正山小種精油的組成成分

由于正山小種精油中乙醇是最主要的成分，在使用GC-MS直接分析正山小種精油樣品過程中，乙醇的峰掩蓋了大量其他揮發性香氣成分，無法獲得有意義的數據。

因此使用GC-MS對正山小種茶湯、正山小種香氣水及大孔樹脂吸附后的殘留吸附液的揮發性香氣成分進行定性及定量分析，從而間接分析正山小種精油的香氣成分。

由表1可知，在正山小種茶湯、香氣水及大孔樹脂殘留吸附液中分別檢測出52、43和11種揮發性香氣成分，其總含量分別為(6.862±0.142)，(5.984±0.080)，(0.491±0.042) μL/L。蒸餾法所獲得的正山小種香氣水保留了絕大部分正山小種中的揮發性香氣成分，提取率約為87.2%。大孔樹脂吸附后所殘留的吸附液所含有的揮發性香氣成分較少，絕大部分被大孔樹脂所吸附，吸附率約為91.8%。其中正山小種中的特征性香氣成分基本被完全吸附，例如正山小種特征性香氣成分順式芳樟醇氧化物、芳樟醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物、香葉醇等在殘留吸附液中含量極低。因此，正山小種香氣水中的特征香氣成分在被充分提取之后能夠被大孔樹脂吸附，并制備成精油。該間接法初步說明了大孔樹脂吸附法可以用于制備具有正山小種特征香氣成分的精油產品。

表1 正山小種茶湯、香氣水及其大孔樹脂吸附液的揮發性香氣成分

續表1

2.3 正山小種精油抗氧化活性測定

使用95%乙醇稀釋正山小種精油，采用ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率評估所制備正山小種精油的抗氧化性，結果如圖4所示。

由圖4可知：該正山小種精油的DPPH自由基和ABTS自由基清除率隨精油稀釋倍數的提高呈遞減趨勢。

圖4 正山小種精油的抗氧化活性

稀釋20倍后，該正山小種精油的DPPH自由基清除率為39.1%；稀釋25倍后，正山小種精油的ABTS自由基清除率仍有29.5%。對比抗壞血酸的DPPH自由基和ABTS自由基清除率可知，該正山小種精油的DPPH自由基清除活力為4 μg/mL抗壞血酸當量；ABTS自由基清除活力為3 μg/mL抗壞血酸當量。

茶葉中的抗氧化成分主要認為是多酚類物質[7-9]，試驗結果表明，正山小種的揮發性香氣成分也具有一定的抗氧化活性，是一種潛在的天然抗氧化劑。Yu等[10]探究了6種不同來源的老鷹茶揮發油的抗氧化活性，結果表明這些揮發油均有一定的抗氧化和抗菌特性；田光輝等[11]研究發現新鮮茶葉揮發油和加工后新茶的揮發油對OH自由基均有清除作用，而新鮮茶葉揮發油對OH自由基有較強的清除作用；Yanagimoto等[12]探究了綠茶、烏龍茶、紅茶揮發性成分的抗氧化活性，發現綠茶揮發性成分的抗氧化活性最好。

3 結論

試驗以正山小種為原料，通過大孔樹脂吸附法制備了正山小種精油，優化了制備工藝。以該優化工藝所制備的正山小種精油具備典型的正山小種的香氣特征，香氣成分的濃縮倍數為35，回收率約為51%，并且具備一定的抗氧化活性。但該方法的整體香氣回收率還有待提高；或者也可通過開發以正山小種加工下腳料為原料制備精油的方法，以降低精油的生產成本。