消化道腫瘤患者MTHFR基因多態性與5-氟尿嘧啶化療不良反應的相關性研究

周 琰， 王蓓麗,2，張春燕,2，潘柏申,2，郭 瑋,2

（1. 復旦大學附屬中山醫院檢驗科，上海 200032；2. 復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科，福建廈門 361015）

二十世紀中期，DUSCHINSKY 等首次報道合成5-氟尿嘧啶（Fluorouracil，5-FU，它作為氟嘧啶類抗腫瘤藥物的關鍵中間體，通過進一步代謝和轉化為活性代謝產物，抑制RNA 和DNA 合成，發揮抗腫瘤作用[1-2]。5-FU 常與奧沙利鉑、靶向藥物等抗腫瘤藥物聯合使用， 是治療消化道實體腫瘤如結腸直腸癌、胃癌等最常用的化療方案[3-4]。

在腫瘤晚期患者中，使用含氟尿嘧啶作為基礎治療方案的化療敏感性只有22%，使用相同劑量的患者對藥物的敏感性差異很大，影響了治療效果。隨著對人類基因組計劃的深入了解，學者們開始嘗試從藥物基因組學、藥物遺傳學的角度研究5-FU 相關藥物基因對化療效果和不良反應的影響[5]。本文旨在研究亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR）基因和毒性預測的相關性，為個體化治療提供依據[6]。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2016年2～6月，復旦大學附屬中山醫院就診的123 例消化道惡性腫瘤患者，其中，男性67 例，女性56 例；年齡32～83 歲，中位年齡61 歲。從外周血樣品中提取基因組DNA 用于檢測MTHFR 1298A＞C 和MTHFR677C＞T 基因多態性。統計98 例治療方案中含5-FU 的患者，比較基因型不同的患者之間發生不良反應類別和程度的差異。98 例患者接受5-FU 聯合奧沙利鉑的化療方案，根據體表面積計算藥物劑量。隨訪期間未發生黃疸和消化道梗阻、造血功能障礙和不伴急性感染。

1.2 儀器和試劑Applided Biosystems 7500 Fast Realtime PCR System[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；AB 3130 型測序儀（美國 ABI 公司）。Lab-Aid 820 核酸抽提Midi 試劑（廈門致善生物科技股份有限公司）；Permix Taq@Hot Start Version[寶生物工程（大連）有限公司]；測序試劑[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及DNA 提?。菏占颊咧委熎陂g的EDTA-K2抗凝血2ml。使用Lab-Aid 820 核 酸抽提Midi 試劑，嚴格按照說明書要求抽提基因組DNA，并保存于-20℃直至檢測。

1.3.2 引物設計及合成：MTHFR 1298A＞C 和MTHFR 677C＞T基因型測定，采用Oligo7 軟件設計PCR引物：MTHFR (1298A＞C) F：AGCTGAAGGACTACTACCTCT；MTHFR (1298A＞C) R：CCCACTCCAGCATCACTCAC；MTHFR (677C＞T) F：CCTATTGGCAGGTTACCCCA；MTHFR (677C＞T) R： CATGCCTTCACAAAGCGGAA。

1.3.3 PCR 擴增：將Premix Taq@Hot Start Version 反應液、正向/反向引物和去離子水，按表1 依次加入0.2 ml PCR 反應管中，PCR 反應總體積為20 μl，震蕩混勻后瞬時離心備用。

表1 PCR 擴增體系配置表

反應條件：94℃，5min；45 次循環（94℃30s；61℃30s；72℃，30s）；72℃5min；4℃，保溫。PCR 擴增產物純化后在ABI3730 測序儀上雙相測序，使用Chromas 軟件分析測序結果。

1.4 統計學分析

1.4.1 數據收集 ：每4 周為一個化療周期，接受2 ～6 次化療。通過整理病史，結合影像學和實驗室結果評估不良反應和嚴重程度。

1.4.2 藥物毒性評價標準：依據美國國立癌癥研究所（National Cancer Institute， NCI）提出的常見不良反應事件評價標準（CTCAE Version 4.0）對胃腸道不良反應和血液系統不良反應進行評價和分級，主要包括白細胞減少、腹瀉、嘔吐和脫發等。

1.4.3 研究終點事件和數據分析：主要終點事件為5-FU 相關的不良事件。使用SPSS19.0 進行統計分析，采用χ2檢驗或 Fisher's 精確概率法，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態性分布情況123 例消化道腫瘤患者的MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態性分布見表2。其中，接受5-FU聯合鉑類化療的98 例患者各基因型分布情況與入組的總體情況相似，見表3（P＞0.05）。

表2 123 例消化道腫瘤患者MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態性分布情況

2.2 123 例消化道惡性腫瘤患者MTHFR 基因的等位基因頻率和Hardy-Weinberg 平衡檢驗在入組患者中分析了MTHFR A1298C 和C677T 等位基因頻率的遺傳平衡。結果顯示，MTHFR A1298C 基因型中，A 和C 等位基因頻率分別為78.05%和21.95%（P=0.87）；MTHFR C677T 基因型中，C 和T 等位基因頻率分別為65.45%和34.55%（P=0.29）。抽樣樣本符合Hardy-Weinberg 平衡定律，具有群體代表性。

對MTHFR A1298C 多態性進行測序，結果見圖1。對MTHFR C677T 多態性進行測序，結果見圖2。

表3 98 例接受5-FU 治療患者MTHFR A1298C 和 C677T 基因多態性分布情況

圖1 MTHFR A1298C 三種基因型AA，AC，CC 的 Sanger 測序結果圖

圖2 MTHFR C677T 三種基因型CC，CT，TT 的 Sanger 測序結果圖

2.3 消化道腫瘤患者年齡、性別、化療方案和MTHFR 基因型與不良反應的關系見表4。根據單因素χ2檢驗模型分析結果，5-FU 相關不良反應的發生率與年齡、性別、化療方案、MTHFR A1298C 多態性之間無顯著相關（P＞0.05），但與MTHFR C677T 多態性存在相關性（P＜0.001）。

2.4 消化道腫瘤患者中MTHFR 基因型和藥物不良反應情況及程度見表5。98 例消化道腫瘤患者中，35 例MTHFR C666T 野生型（CC）患者中發生3～4 級消化道不良反應0 例；3～4 級中性粒細胞減少1 例。在63 例MTHFR C666T 突變型（CT+TT）患者，發現11 例3～4 級消化道不良反應；3 例3～4 級中性粒細胞減少癥。65 例MTHFR A1298C 野生型（AA）患者，發現2 例3～4 級消化道不良反應；3～4 級中性粒細胞減少癥0 例。33 例MTHFR A1298C 突變型（AC+CC）患者，發現4例3～4 級消化道不良反應；3～4 級中性粒細胞減少癥1 例。MTHFR C677T 突變基因型（CT+TT）可以增加3 級以上不良反應和消化道不良反應的發生風險，不增加中性粒細胞減少癥的風險。MTHFR A1298C 基因型不增加患者3 級以上不良反應的發生風險。

3 討論

5-FU 通過抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶抑制DNA 合成，是一類具有廣譜抗腫瘤作用的抗嘧啶類藥物。它被單獨或聯合應用于各種實體腫瘤治療方案。5-FU 的標準計量通常是根據患者體表面積計算而得，但在實際臨床應用中，使用相同校準劑量的患者藥物療效和不良反應發生程度存在顯著差異，甚至發生藥物不敏感和嚴重致死性不良反應[7-8]。據報道，多個基因多態性在抗嘧啶類藥物代謝過程中起著重要作用，例如二氫嘧啶脫氫酶（dihydropymidine dehydrogenase ，DPD）、 胸 腺嘧啶核苷酸合成酶（thymidylate synthase, TS）、胸腺嘧啶磷酸化酶（thymidine phosphorylase, TP）和MTHFR 等基因的多態性。在本文中，我們研究通過葉酸代謝途徑，由MTHFR 基因C677T 和A1298C 多態性引起的藥物毒副作用，協助臨床選擇合適的化療藥物，推進個體化精準醫療[9-12]。

本研究中MTHFR C677T 和A1298C 等位基因頻率遺傳平衡P＞0.05，說明抽樣樣本代表了一個處于隨機婚配平衡狀態的大規模群體，符合吻合度檢驗要求。

我們的研究中，漢族人群MTHFR C677T 突變基因型（CT+TT）的頻率（59.3%） 高于MTHFR A1298C 突變基因型（AC+CC）的頻率（38.2%），更為常見。其中，MTHFR C677T 基因型檢測結果，野生型 CC 50 例（40.65%）,雜合子CT 61 例（49.59%）和純合子TT 12 例（9.76%），與文獻報道（野生型48.6%，雜合突變型45.8%，純合突變型5.6%）相一致；A1298C 基因多態性頻率和Pubmed 索引的結果基本一致（野生型59.0%，雜合突變型34.9%，純合突變型6.1%）[10,13-14]。

5-FU 相關不良反應呈劑量限制性[15-17]，同時體內代謝過程為非線性方式，進一步加劇了個體間的療效差異。98 例采用5-FU 聯合鉑類化療方案的患者均使用小劑量44h 連續靜脈滴注的給藥方式，排除劑量差異對毒副作用分析的影響。

根據χ2檢驗結果，5-FU 相關不良反應的發生與年齡、性別、化療方案、MTHFR A1298C 多態性無顯著相關性（P＞0.05）。然而，它與MTHFR C677T 基因多態性存在相關（P＜0.05），這與文獻報道一致[10]。

5-FU 作為廣譜的實體腫瘤化療藥物，使用過程中常見的不良反應一直受到臨床普遍關注，主要包括胃腸道反應，尤其是致死性出血性腹瀉。在嚴重的情況下，骨髓抑制可誘發三系下降，全血細胞減少，以及脫發、共濟失調等[18]。多年來，持續有研究報道了5-FU 相關不良反應。2000年后，學者們開始從藥物基因組學角度來研究上述不良反應發生的原因。MTHFR 是葉酸代謝過程中的關鍵酶，可將還原型葉酸轉變為5-甲基四氫葉酸（5-MTHF），使一磷酸脫氧核糖氟尿嘧啶核苷（fluorodeoxyuridylate，FdUMP）、TS 和還原型葉酸組成的復合物減少，從而減弱5-FU 的腫瘤抑制作用[19]。

最常見的MTHFR 基因多態性是第677 位密碼子發生T 到C 的突變。SOHN 等[20]在結腸癌細胞研究中發現，攜帶變異型的癌細胞MTHFR 活性降低，細胞增殖速度加快，相對5-FU 的敏感性也增高。MTHFR基因型對細胞內葉酸濃度和分布也有影響，進而改變腫瘤細胞生長速度和藥物敏感性。

本研究中，MTHFR C677T基因突變型（CT+TT）患者中，共發生不良反應21 例，其中3～4 級嚴重胃腸道不良反應11 例，3～4 級中性粒細胞減少3例。MTHFR C677T 突變型顯著增加了3 ～4 級不良反應的發生率和3～4 級胃腸道不良反應發生的風險（P＜0.05），這和國內外研究數據是一致的[10,19]。MTHFR 基因多態性對酶活性有明顯影響，攜帶MTHFR 677C＞T 等位基因的患者在化療過程中發生消化系統和血液系統不良反應的概率及療效有統計學意義。有報道攜帶MTHFR 677C＞T 基因突變型（CT+TT）的患者，在使用 MTX 后發生腹瀉的風險高于野生型患者，差異有統計學意義。

有文獻報道MTHFR C677T 多態性會增加血液系統不良反應發生風險，例如白細胞減少、血小板減低[21]。然而，我們的研究中MTHFR C677T 多態性不增加中性粒細胞減少的發生風險。這可能是由于：①采血時間和相關文獻報道有差異。為了避免化療后發生感染等危險并發癥，本研究在化療結束后14 天復查血細胞檢測，錯過血液學變化最顯著的化療后第7 天。②入組樣本例數有限。后續，我們將進一步擴大樣本量再行分析。

綜上所述，我們的研究結果表明MTHFR C677T 多態性可增加5-FU 相關不良反應的發生率，尤其是3 ～4 級胃腸道反應的風險；MTHFR A1298C 多態性、年齡、性別和化療方案與5-FU 相關的不良事件無顯著相關性。檢測MTHFR 基因多態性可以幫助臨床制定個性化化療方案，預測和減少不良反應的發生。