小鼠海馬神經元急性振動分離及電生理活性鑒定

石 璇，李雙濤，吳 杰，高分飛

（汕頭大學醫學院 1.藥理學教研室，2.腦功能與疾病實驗室，廣東 汕頭 515041）

獲得特定腦區形態和活性良好的單個神經細胞，是研究特定腦區神經元生理功能和藥理特性的基本條件。雖然目前已經能夠成功培養存活2周以上的原代神經元細胞，但原代培養還只限于取材胚胎或新生幼仔的腦組織，這與成年神經元細胞在生理功能和藥理特性上還是有一定不同；而且酶解分離培養需要大量的組織細胞，只取材特定腦區的組織，如海馬CA1區，獲得的細胞數太少；加上無菌條件下取材特定腦區組織的操作相對煩瑣，使得原代培養還無法完全取代急性分離方法。本研究探索建立一種小鼠特定腦區神經元的急性振動分離方法，通過膜片鉗記錄技術對其進行電生理特性檢測，評估分離效果。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與儀器

C57BL/6J小鼠，12～18 d，雌雄不限，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

HEPES、Tris、兩性霉素B、葡糖酸鉀、瓊脂糖、谷氨酸、N-甲基-D-天冬氨酸（N-Methyl-D-aspartic acid，NMDA）、甘氨酸均購自美國Sigma-Aldrich公司，鏈霉蛋白酶購自德國Calbiochem公司，其余所用無機鹽均為市售分析純試劑。CompresstomeTMVF-200振動切片機購自美國Precisionary Instruments公司。膜片鉗系統組件包括：Axopatch 200B放大器、Digidata 1322A數字轉換器（美國MDC公司），IX71倒置顯微鏡（日本Olympus公司），MC1000e顯微操作器（美國SD公司），PP-830微電極拉制儀（日本Narishige公司）。HW-1000超級恒溫水浴購自成都泰盟軟件有限公司；WZ-II臺式真空泵購自上海之信儀器有限公司；自制針式振動細胞分離器，示意圖見圖1，將拉制的玻璃微電極尖端以火拋光成直徑0.1 mm左右的圓球形，固定于電磁繼電器的銜鐵上，通過方波刺激器控制振動頻率；自制U形管給藥系統。

圖1 振動分離神經元裝置示意圖

1.2 溶液配制

分離液：蔗糖212.7 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，MgCl23 mmol/L，CaCl21 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室溫下通以95%（體積分數）O2和5%（體積分數）CO2混合氣飽和，pH 7.4。人工腦脊液：NaCl 124 mmol/L，KCl 5 mmol/L，NaH2PO41.25 mmol/L，NaHCO326 mmol/L，MgCl22 mmol/L，CaCl22 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，室溫下通以95%（體積分數）O2和5%（體積分數）CO2飽和，pH 7.4。標準液：NaCl 150 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.4。膜片鉗實驗電極內液：葡糖酸鉀150 mmol/L、MgCl28 mmol/L、HEPES 10 mmol/L，用Tris滴定pH至7.2。20 mg兩性霉素B溶于1 mL二甲基亞砜中配成母液，每10 μL分裝于0.5 mL EP管中避光冷凍備用。

1.3 海馬CA1區錐體細胞分離

小鼠經異氟烷吸入麻醉，迅速開胸，左心室快速推注冰冷的分離液約10 mL，灌流腦組織。斷頭，剪開頭頂皮毛分兩邊，沿矢狀縫和人字縫剪開顱骨，將2片顱骨掀開，取腦放入冰冷的分離液中約1 min。用瓊脂糖包繞固定，在冰浴下用振動切片機沿冠狀面切成400 μm厚的腦片，轉移至持續通95%O2和5%CO2的人工腦脊液中，室溫下孵育1 h。將腦片轉移至加入鏈霉蛋白酶（1 mg/6 mL）的人工腦脊液中，根據鼠齡在31℃酶解20～40 min，酶解過程中持續通入95%O2和5%CO2。酶解結束將腦片轉移至人工腦脊液中，穩定20 min左右。將腦片轉移至盛有氧飽和標準液的35 mm培養皿中，以U型網狀腦片固定小配件（美國Warner Instruments公司）壓住腦片防止移動，在倒置顯微鏡低倍鏡下找到海馬CA1區，將玻璃針頭置于其上，以方波刺激器控制振動頻率為4～5 Hz，水平振動幅度大約1 mm，逐漸下壓振動海馬CA1區組織，使組織松散，神經元細胞脫逸出來。最后取出腦片，讓分離出的神經元細胞靜置10 min左右貼壁，即可用于膜片鉗實驗。

1.4 穿孔膜片鉗記錄

選擇胞體較大、細胞輪廓清晰、軸突較粗和長的神經元置于倒置顯微鏡工作臺中央，用標準液作為細胞外液灌流，貼壁牢固者為佳。玻璃微電極（G-1.5，日本Narishige公司）由拉制儀分兩步拉制而成，電極電阻通常為5～6 MΩ；將電極尖端浸入電極內液中，利用毛細現象使電極尖端先吸入一些電極內液，再反向充灌含400 μg/mL兩性霉素B的電極內液。調節微操縱器使電極尖端輕輕壓上細胞后，施加少許負壓，形成吉歐封接。等待兩性霉素B慢慢打孔，形成穿孔全細胞模式。

2 結果

2.1 急性分離小鼠海馬CA1區神經元的形態

相差顯微鏡下觀察分離的海馬神經元，狀態和活性好的細胞一般保留基本形態特征，包括胞體、樹突和軸突，胞體呈錐形或三角形，整個細胞胞膜清晰、胞體透亮、胞漿均勻一致，并保存有較長的軸突、樹突，立體感較強，貼壁好（圖2）。若細胞損傷較嚴重或死亡，則胞膜模糊，突起斷裂或呈串珠狀，胞漿有明顯的黑色顆粒。

圖2 急性分離C57BL/6J小鼠海馬CA1區神經元

2.2 小鼠海馬CA1區神經元電生理特性

分離的小鼠海馬CA1區錐體細胞易于形成高阻封接，電極尖端接觸細胞后給予很小負壓即可形成高阻封接。活性良好的錐體細胞常有自發的動作電位發生，兩性霉素B穿孔后，在電流鉗制模式下即可觀察到自發和誘發的動作電位（圖3）。細胞的活性與細胞的靜息膜電位相關，活性好的細胞靜息電位均在-50 mV以上（由于未作串聯電阻和漏電流補償，與真實值有一定差異）；活性差的細胞靜息電位值低，自發動作電位少，低于-40 mV即使給予電流刺激也誘發不出動作電位。

圖3 電流鉗模式下小鼠海馬CA1區錐體細胞自發和誘發的動作電位

在電壓鉗模式下，鉗制電位為-20 mV，以步階為10 mV復極化到-50～-30 mV，脈沖寬度為1 s，可記錄到復極化的電壓依賴性鉀電流M，見圖4。

圖4 小鼠海馬CA1區錐體細胞的M電流

在電壓鉗模式下，鉗制電位=-50 mV，U形管快速給藥系統管口距細胞約100 μm，將含1 mmol/L谷氨酸的標準液，加于錐體細胞周圍1 ms，然后迅速沖走，可記錄到谷氨酸受體依賴性離子通道內向電流；若將含100 μmol/L NMDA和3 μmol/L甘氨酸的標準液，加于錐體細胞周圍1 ms，可記錄到NMDA受體依賴性離子通道內向電流（圖5）。

圖5 小鼠海馬CA1區錐體細胞的谷氨酸和NMDA受體依賴性離子通道電流

3 討論

腦組織神經元細胞的傳統分離方法是腦組織切片后酶解，然后分離特定腦區的組織，用管口口徑從粗到細的吸管逐級吹打，得到單個分離的細胞[1-2]。本文中所用分離方法的原理和傳統分離方法相似，在腦組織酶解松散以后，用機械吹打或振動的形式，使細胞脫離下來。但吹打的分離方法常用于大鼠的腦組織，因為小鼠等小動物的某些核團或功能區太小，解剖鏡下選取不易準確定位，分離時易連帶其他腦區組織。而玻璃微電極尖端細小，振動幅度才1 mm左右，在40倍鏡下選取腦區較精準。我們的實驗結果顯示，分離的神經元不僅形態特征保持較完整，而且不需要多聚賴氨酸涂層，分離的神經元也能穩定貼壁于清潔培養皿。并且分離的神經元還保持了良好的電生理活性。Akaike等[3]發現酶消化易破壞神經元細胞膜上的NMDA受體通道，而本法可記錄到這類受體通道電流。當技術掌握純熟的時候，對于幼齡的腦組織，還可以不經過酶消化，直接在腦片上振動分離得到細胞。這種純機械分離的神經細胞胞體上還帶有許多突觸前膜[4]，可以檢測反映細胞間突觸聯系的突觸后電流。

理論上，腦片越薄越有利于氧和養分的滲入，使得神經細胞活性保持越長久。但一般認為，腦片切面100 μm內的細胞是受損的，故而刨除上下2個切面附近的受損細胞，腦片厚度至少要大于200 μm。對于腦片膜片鉗實驗，只要腦片內有少量的活性細胞就可以滿足實驗的需要，所以腦片厚度一般切250 μm即可；而對于分離單個神經細胞，在機械分離過程中又會損傷絕大多數細胞，腦片中必須有較大數量的活性細胞才能保證小概率下獲得幾個形態和活性良好的細胞，綜合兩方面因素，分離神經細胞的腦片厚度以400 μm為宜[5]。

小鼠海馬CA1區腦組織對缺氧敏感，在孵育及酶處理過程中必須連續不斷地供給氧氣。通氣時要注意防止腦片隨氣泡翻動。從我們的經驗來看，小鼠海馬CA1區腹側腦組織比背側更強壯，同樣條件下，腹側分離的好細胞要更多些。分離下來的神經細胞，活性隨著時間延長下降較快，大概3 h后，活性普遍明顯下降。故而實驗過程中，首先要挑選細胞形態最好的培養皿中的最好的細胞進行實驗，以免按分離順序進行下來，每個細胞活性都不是最好，每個結果都不太理想。

綜上所述，急性振動分離法分離的神經元不僅具有較好的電生理活性，而且可以較精準地分離特定腦區的神經元，是研究特定腦區單個神經元生理功能和藥理特性的一種好方法。