復明片治療青光眼的活性成分及可能作用靶點的網絡藥理學研究

黃丹梅，陳一村

（汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

青光眼被中醫稱為內障病，中藥治療青光眼自古即有。中醫臨床認為，內障病主要致病原因是肝氣受損、臟器不和。復明片為補益類中成藥，有滋補肝腎，養陰生津，清肝明目之功效。主治肝腎陰虛所致的羞明畏光、視物模糊。研究證實復明片能有效改善青光眼患者高眼壓及視神經損傷等癥狀，復明片水溶液給家兔滴眼可明顯縮小瞳孔直徑，降低眼內壓[1-2]。復方中藥作用特點是多成分、多靶點、多途徑，普通中藥作用機制研究仍沿用西藥“一藥物、一基因、一疾病”模式，這種研究方法對中藥的作用機制僅是以管窺天，只見一端。網絡藥理學是基于系統生物學與多向藥理學理論，采用計算機模擬技術及高通量組學分析，對藥物作用機制進行挖掘分析的新學科[3]。本研究利用網絡藥理學探討復明片治療青光眼的活性成分和可能作用靶點。

1 材料與方法

1.1 數據庫與軟件

TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）；STRING數據庫11.0（https://string-db.org）；PDB數據庫（https://www.rcsb.org）；AutoDockTools 1.5.6（http://autodock.scripps.edu/resources/adt）；AutoDock Vina 1.1.2（http://vina.scripps.edu）；Cytoscape 3.3.0（https://cytoscape.org/）；PyMOL 1.7（http://pymol.org）。

1.2 復明片活性成分的篩選

利用TCMSP數據庫檢索復明片的中草藥化學成分，將口服利用度＜30%的和藥物相似性＜0.18的成分剔除[4-5]。采用ChemBioDraw Ultra 12.0軟件繪制化合物的結構，然后用ChemBio3D Ultra 12.0軟件轉化為三維結構，并使用MMFF94力場進行優化，輸出mol2格式結構，再通過AutoDockTools 1.5.6軟件轉變為pdbqt格式。

1.3 活性成分及治療靶點的選擇

利用TCMSP數據庫搜索青光眼（glaucoma）疾病的治療靶點。將青光眼的治療靶點導入STRING數據庫中，限定研究物種為“Homo Sapiens”，獲得蛋白互作關系，并通過該網站得到相應PDB蛋白晶體模型的鏈接。再從PDB數據庫下載具有蛋白質—配體復合物的晶體模型，通過AutoDockTools1.5.6軟件及其附帶的激動劑化合物確定作用位點的三維坐標。無相應的PDB蛋白晶體的靶點則通過瑞士生物信息研究所網站（http://www.hpc-ch.org/sib/）進行同源性建模[6]。

1.4 分子對接模擬試驗

采用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接研究。三維坐標參數“exhaustiveness”設置為8。對接結果選取打分值最高的構象[7-10]。選取與網絡藥理作用的核心蛋白對接分數最高的幾個化合物，用軟件PyMOL 1.7繪圖。

1.5 復明片活性成分—靶點的網絡構建

STRING數據庫得到的靶點互作關系與分子對接模擬試驗得到的蛋白靶標作用的復明片活性成分一起用Cytoscape 3.3.0軟件構建復明片活性成分—靶點互作網絡關系圖。并通過Cytoscape軟件的“Network Analyzer”工具分析網絡各點的作用關系，同時獲得網絡藥理作用的核心蛋白。

2 結果

2.1 復明片總方分子數據庫的建立

通過TCMSP數據庫共檢索到復明片的化學成分1109個，其中山茱萸226個、車前子55個、夏枯草60個、決明子68個、人參190個、枸杞子188個、菟絲子29個、女貞子119個、黃連48個、谷精草24個、木通43個、地黃76個、澤瀉46個、茯苓34個、牡丹皮55個、檳榔52個。篩選后得到183個活性化學成分，山茱萸20個、車前子9個、夏枯草11個、決明子14個、人參22個、枸杞子45個、菟絲子12個、女貞子13個、黃連14個、谷精草8個、木通8個、地黃2個、澤瀉2個、茯苓15個、牡丹皮11個、檳榔8個，其中交集化合物39個。

2.2 復明片活性成分—靶點網絡

STRING數據庫獲得的靶點關系（表1）及靶點對接后的數據用Cytoscape合并構建復明片活性成分—靶點網絡圖（圖1）。圖中共191個節點，963條邊，其中紅色的點代表蛋白，綠色的點代表藥物，邊則代表蛋白或藥物彼此的作用關系，節點的大小表示其受其他點作用的多少。圖1中碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白節點明顯大于其他蛋白。

表1 青光眼靶點蛋白

2.3 分子對接結果

利用AutoDock Vina 1.1.2軟件對篩選出的活性化合物和靶點進行分子對接，以蛋白附帶的原配體作為對接結果的標尺，發現復明片中活性成分與碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白結合的親和力大于原配體（表2），表明碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白與復明片中活性成分有較好的結合活性。對接情況見圖2～圖4。

圖1 復明片活性成分—靶點網絡

表2 分子對接結果

圖2 碳酸酐酶Ⅰ對接圖

圖3 碳酸酐酶Ⅱ對接圖

圖4 碳酸酐酶Ⅳ對接圖

3 討論

本研究通過構建復明片活性成分—靶點網絡，發現碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ蛋白節點明顯大于其他蛋白，提示這3個蛋白可能是復明片治療青光眼的關鍵靶點。碳酸酐酶是一種含鋅金屬酶，哺乳動物體內已發現13種碳酸酐酶同工酶和3種碳酸酐酶相關蛋白，它們的結構、分布和性質各異，多與各種上皮細胞分泌H+和碳酸氫鹽有關[11]。目前用于青光眼治療的藥物，主要有β受體阻斷劑、α受體激動劑、M膽堿受體激動劑、前列腺素衍生物、碳酸酐酶抑制劑及其復合制劑。而其中碳酸酐酶抑制劑主要針對睫狀體上的碳酸酐酶Ⅱ受體。本研究中碳酸酐酶Ⅱ分布在睫狀體中，碳酸酐酶Ⅳ分布在視網膜和視網膜上皮中，而碳酸酐酶Ⅰ的分布未有提及，但均有催化CO2和H2O生成H+和HCO3-，調節電解質平衡的作用。碳酸酐酶在上皮細胞中催化CO2和H2O生成H+和HCO3-，透過腔膜分泌于房水中。由于房水中的液體要保持電中性，Na+向房水分泌增加，同時帶動Cl-向房水移動，從而使房水形成高滲壓，于是促進H2O向房水流動，保持房水平衡和正常的pH值，而青光眼患者由于房水回流不暢，引起眼壓升高[12-13]。而本研究分子對接結果顯示復明片的有效成分均對碳酸酐酶的3種同工酶均具有較強的結合能，據此我們猜測復明片降低眼內壓的原因可能因為藥物成分抑制碳酸酐酶而減少眼內碳酸氫鹽的形成，從而使房水的產生減少，導致眼內壓降低。通過血管進入后房的陽離子主要是Na+，當HCO3-與Na+結合形成NaHCO3時，房水滲透壓升高，從而吸收水分使房水生成增加。如果抑制了碳酸酐酶的活性，使H2CO3生成減少，也就使HCO3-生成減少，即可導致房水生成減少，眼壓降低[14]。

綜上所述，本研究結果表明碳酸酐酶Ⅰ、碳酸酐酶Ⅱ和碳酸酐酶Ⅳ可能是復明片治療青光眼的關鍵靶點。分子對接模擬試驗也驗證了預測的活性成分和靶點具有較好的結合活性，說明本研究的預測具有一定的可靠性，可以為進一步研究復明片治療青光眼提供新的參考方向。