快速眼動睡眠剝奪對抑郁模型大鼠海馬區膠質細胞源性神經營養因子的影響

王 建，邵 園，張印南，李 慧，朱 俊，許崇濤

（1.深圳市康寧醫院//深圳市精神衛生中心，廣東 深圳 518000；2.汕頭大學精神衛生中心，廣東 汕頭 515041）

睡眠剝奪是目前抗抑郁治療起效最快的方法之一[1]，但具體作用機制尚不明確。海馬作為皮質邊緣系統的重要組成部分，與學習、情感、應激反應等腦功能有密切的聯系，抑郁癥的發生及抗抑郁治療機制方面的研究重點已經聚焦到了海馬。近年來有學者提出了抑郁癥的“神經營養因子假說”[2]，認為抑郁是由于海馬區神經營養因子水平降低導致神經元萎縮，海馬神經發生降低及膠質細胞缺失；而抗抑郁治療能夠阻斷或者反轉神經營養因子的缺失，進而反轉細胞的萎縮和缺失。膠質細胞源性神經營養因子（glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）作為神經營養因子中的重要一員，在海馬區高表達，對神經膠質細胞、多巴胺能、血清素能、去甲腎上腺素能神經元的生長和維護能產生廣泛的神經營養作用。有文獻[3]報道大鼠在慢性不可預知溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS） 后，海馬區GDNF的表達降低，而應用抗抑郁藥治療則會恢復GDNF的正常表達。故本研究選取海馬區GDNF作為研究點，首次在CUMS誘導的抑郁大鼠模型上，觀察快速眼動睡眠剝奪（rapid eye movement sleep deprivation，REMSD）對大鼠行為學及海馬區GDNF表達的影響，進一步探索睡眠剝奪快速抗抑郁效應的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18只成年雄性SD大鼠由汕頭大學醫學院動物實驗中心提供，體質量220～300 g，SPF級。動物房通風良好，室溫控制在22℃，自然光照，自由進食、飲水。適應1周后正式開始實驗。

1.2 主要試劑

GDNF抗體（sc-328）購自美國Santa Cruz公司，β-actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、超敏ECL化學發光試劑盒BeyoECL Plus均購自江蘇碧云天生物技術有限公司，RIPA Buffer（9806s）購自美國Cell Signaling公司，蛋白酶抑制劑（5892970001-1）購自瑞士Roche公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Pierce公司，PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 實驗大鼠隨機分為正常對照組、應激造模組和REMSD組，每組6只。對所有大鼠進行首次開場實驗。然后應激組和REMSD組給予連續28 d CUMS，再對所有大鼠進行第2次開場實驗。隨后REMSD組進行連續72 h REMSD，最后對所有大鼠進行第3次開場實驗。斷頭取海馬，采用蛋白質印跡法檢測各組大鼠海馬區GDNF的表達。

1.3.2 CUMS模型制備 參照本研究組既往研究方法[4]，將禁食24 h、禁水24 h、夾尾1 min、行為束縛限制2 h、4℃冰水游泳5 min、明暗顛倒24 h、鼠籠傾斜45°24 h、潮濕墊料10 h、空瓶放置5 h、40℃高溫環境中振蕩10 min、電擊足底（電流強度1.0 mA，每次持續1 s，6次/min，共10 min）共11種刺激隨機安排到28 d內，每種刺激平均出現2～3次，同種刺激不能連續出現，每日1種刺激，使大鼠不能預料刺激的發生。

1.3.3 REMSD模型建立 采用小平臺水環境法，選用長36 cm、寬32 cm、高30 cm的塑料水槽，其中放置1個直徑6.3 cm、高8.0 cm的平臺，在平臺周邊注滿水，水面距平臺面約1.0 cm，大鼠在平臺上可自行飲食、飲水，水溫保持在22℃左右。當大鼠進入快眼動睡眠時，由于全身肌張力降低，節律性地垂頭觸水或落入水中而覺醒，從而使大鼠始終不能進入快速眼動睡眠。

1.3.4 開場實驗 應用DigBehv動物自發活動行為視頻跟蹤分析系統（上海移數信息科技有限公司）檢測，觀察箱長×寬×高為50 cm×50 cm×65 cm，房間隔音、隔光，15:00～17:00在黑暗的觀察箱內進行實驗，每只大鼠觀察時間5 min。動物的活動情況通過紅外攝像系統和視頻合成器，由計算機記錄大鼠的運動軌跡，分析總路程、中央區活動路程的改變。在應激前、應激后及72 h REMSD后共測定大鼠的自發活動3次。

1.3.5 蛋白質印跡法檢測大鼠海馬區GDNF的表達 取大鼠腦組織，加入RIPA裂解液，冰上研磨成勻漿，4℃、12 000 r/min離心5 min。BCA法測定蛋白含量。取100 μg總蛋白，5%～12%SDSPAGE電泳分離后轉移到PVDF膜，室溫封閉2 h后加入相應一抗，孵育過夜。然后再加入相應二抗，室溫孵育2 h。ECL化學發光顯影定影。

1.4 統計學方法

采用EXCEL 2003和SPSS 13.0統計軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用LSD（通過齊性檢驗）和非參數檢驗（未通過齊性檢驗），自身前后比較采用配對t檢驗，兩樣本均數比較采用獨立樣本t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應激和REMSD對大鼠開場實驗自發活動的影響

各組大鼠在應激前活動路程差異均無統計學意義（P＞0.05）。應激后與正常對照組相比，應激造模組和REMSD組大鼠的總路程、中央路程均降低（P＜0.01），表明大鼠經過28 d CUMS后出現抑郁樣行為。REMSD組第3次開場實驗和第2次開場實驗相比，總路程、中央路程均增加（P＜0.01），表明REMSD改善了大鼠的抑郁樣狀態。見表1。

2.2 應激和REMSD對大鼠海馬區GDNF表達的影響

應激造模組大鼠海馬區GDNF表達水平較正常對照組降低（P＜0.01）；REMSD組大鼠海馬區GDNF表達水平較正常對照組降低（P＜0.05），但與應激造模組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

表1 大鼠自發活動開場實驗 （m，±s）

表1 大鼠自發活動開場實驗 （m，±s）

1）與正常對照組相比，P＜0.01；2）與REMSD組第2次實驗結果相比，P＜0.01；3）與應激造模組相比，P＜0.01。

組別正常對照組（n=6）應激造模組（n=6）REMSD組（n=6）第1次總路程20.80±1.62 20.49±1.81 20.97±1.44中央路程1.79±0.26 1.87±0.32 1.84±0.30第2次總路程19.44±2.48 5.32±1.541）5.12±1.721）中央路程1.79±0.31 0.54±0.281）0.55±0.211）第3次總路程21.01±2.02 5.18±1.431）21.24±1.902） 3）中央路程1.80±0.33 0.50±0.241）1.85±0.252） 3）

圖1 應激與REMSD對大鼠海馬區GDNF蛋白表達的影響

3 討論

CUMS被廣泛應用于抑郁癥的動物模型，其有效性可持續幾個月，具有較好的表面效度，符合抑郁模型的要求[5]。本研究應激組、REMSD組大鼠在CUMS 28 d后，自發活動開場實驗中總路程和中央路程較正常對照組均減少，表明大鼠應激后自發活動減少，出現抑郁樣行為。與抑郁癥患者的興趣下降、意志活動減退具有一定程度的相似性。本研究中CUMS在導致大鼠出現抑郁樣行為的同時，能夠降低海馬區GDNF蛋白的表達，與Liu等[3]的研究一致。提示CUMS可能通過降低海馬區GDNF的表達導致大鼠出現抑郁樣行為，海馬區GDNF表達降低可能是抑郁癥的發生機制之一。已有文獻[6-7]報道抑郁癥病人外周GDNF的表達降低。最近有研究發現GDNF能夠通過誘導抗氧化物和降低氧化應激水平，對中樞神經系統起到保護作用[8]，而抑郁癥經常伴發神經炎癥及氧化應激水平的增高[9]。因此，我們推測GDNF的表達降低有可能是減少對神經的保護作用而在抑郁癥的發生機制中起重要作用。

本研究還發現，大鼠經過72 h REMSD后，其自發活動增加，提示REMSD可以改善大鼠的抑郁樣行為。這與既往研究結果是一致的，睡眠剝奪能夠快速改善抑郁癥患者的抑郁情緒，其在24 h內即可發揮抗抑郁效應[10]，而服用抗抑郁藥常需要2周甚至更長的時間才能起效。REMSD可以發揮快速抗抑郁作用，這為我們探索新的抑郁癥治療策略提供了一定方向。

本實驗并未發現REMSD 72 h對抑郁模型大鼠海馬區GDNF的表達有明顯影響，結合行為學結果提示GDNF本身可能并未參與REMSD快速抗抑郁的機制。既往文獻[11-12]報道在動物模型上應用抗抑郁藥，同樣對海馬區GDNF的表達無明顯影響。尸檢研究也發現服用抗抑郁藥對抑郁癥病人的海馬等多個腦區GDNF的表達無明顯影響[13]。臨床研究也發現服用抗抑郁藥對血清GDNF水平無明顯影響[14]。Chen等[11]研究發現電休克治療對大鼠海馬區GDNF mRNA的表達無明顯影響，但增加了海馬區GDNF受體GFRα1和GFRα2 mRNA的表達，這提示GDNF受體的高表達可能是電休克治療抑郁癥的機制之一。本研究未檢測GDNF相關受體的表達變化，有可能其受體的表達變化在介導REMSD快速抗抑郁機制方面起重要作用。另外，抑郁癥患者不同腦區GDNF表達水平也可能存在差異[2]，我們的研究僅檢測了海馬區GDNF的變化，未來的研究應該繼續檢測額葉、紋狀體等腦區，通過對多腦區、多通路的研究來更好地探索睡眠剝奪快速抗抑郁的機制。

綜上所述，CUMS可能通過降低海馬區GDNF的表達導致大鼠出現抑郁樣行為，REMSD可以快速改善大鼠的抑郁樣行為，但GDNF本身可能并未參與其中快速抗抑郁的機制。