基于GC-MS技術研究地芬諾酯對大鼠肝臟組織代謝的影響

許慧芳

[摘要]目的 研究地芬諾酯對大鼠肝臟組織代謝的影響。方法 將32只SD大鼠隨機分為四組：地芬諾酯給藥組（低、中、高三個劑量組）和對照組，每組8只，采集肝組織氣相色譜-質譜（GC-MS）圖譜，用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）進行分析，找出差異代謝產物。結果 與對照組比較，地芬諾酯組肝組織中丁酸、丙酸、甘油、亮氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、谷氨酰胺、木酮糖、赤蘚糖、9H-嘌呤、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、花生四烯酸肝組織代謝物水平均升高，而肌醇水平下降（P<0.05）。結論 這些代謝物的變化表明給藥后的大鼠氨基酸代謝、脂類代謝和能量代謝都發生了異常，該研究可為地芬諾酯肝臟代謝提供有用信息。

[關鍵詞]代謝組學;氣相色譜質譜聯用;地芬諾酯;肝毒性

[中圖分類號] R927.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）6（a）-0011-03

[Abstract] Objective To study the effect of Diphenoxylate on liver tissue metabolism in rats. Methods Thirty-two SD rats were randomly divided into four groups： Diphenoxylate administration group （low， medium， and high dose groups） and control group， with 8 rats in each group. The gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） of the liver tissue was collected and analyzed by partial least-squares discriminant analysis （PLS-DA） to identify different metabolites. Results Compared with the control group， the levels of these metabonomics in liver tissue such as butyric acid， propionic acid， glycerin， leucine， glycine， L-aspartic acid， glutamine， xylulose， erythrose， 9H-purine， gluconic acid， D-mannitol， galactose， and arachidonic acid increased， while the level of inositol myo-inositol decreased （P<0.05）. Conclusion The changes of these metabolites indicate abnormalities in amino acid metabolism， lipid metabolism， and energy metabolism in rats after administration. This study can provide useful information for liver metabolism of Diphenoxylate.

[Key words] Metabolomics; Gas chromatography-mass spectrometry; Diphenoxylate; Hepatotoxicity

地芬諾酯是哌替啶的衍生物，可作為阿片類藥物的替代品[1]。地芬諾酯片的正常使用不會使人上癮，因此不在嚴格控制藥物之列，患者很容易在藥店和醫院買到。在沒有麻醉劑的情況下，吸毒者可能會購買大量的地芬諾酯片作為替代品，而大劑量長期服用地芬諾酯會導致中毒[2-4]。氣相色譜-質譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）不僅具有廣譜測定、分離復雜混合物的能力，而且具有較高的靈敏度、良好的重復性和線性響應，加上其龐大的化合物庫，為鑒定工作帶來了極大的便利[5-6]。近年來，GC-MS已廣泛應用于人類和動物的代謝組學研究，其目的是為了發現毒理學和生物標志物，進行疾病的診斷和分類[7-8]。Wen等[9]為氯胺酮濫用后的大腦組織提供有用的生物標志物。本研究基于GC-MS的代謝組學技術，旨在探討大鼠灌胃地芬諾酯后所引起的肝毒性，以期能為臨床用藥給予一定的幫助，現報道如下。

1材料與方法

1.1儀器與條件

Agilent自動進樣器在不分流模式下加入1.0 μl最終衍生物。色譜分離采用安捷倫6890N氣相色譜儀，色譜柱為HP-5MS（30 m，i.d.，0.25 μm，0.25 mm）。柱溫箱溫度設定為100℃，恒定5 min，然后以10℃/min的速度上升到300℃，并保持恒定10 min。質譜檢測采用電子轟擊電離（EI）模式，電子能量為70 eV，離子源溫度為250℃，然后在50～550 m/z的質量范圍內，以1 scan/s的速度采集樣品。

1.2主要藥物與試劑

地芬諾酯購于上海宸功生物技術有限公司;N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）和三甲基氯硅烷（TMCS）購于Sigma;乙腈購于天津市康科德科技有限公司。

1.3動物處理和樣品采集

32只體重（220±20）g雄性SD大鼠[合格證號：SYXK（浙）2015-0009]均來自溫州醫科大學實驗動物研究中心，置于自然光照黑暗循環的（22±2）℃環境中。所有涉及動物及其護理的操作均按照《實驗動物護理原則》和《溫州醫科大學實驗動物護理使用指南》執行。實驗前1周適應后，將大鼠隨機分為低劑量組、中劑量組、高劑量組和對照組，每組8只。將地芬諾酯按12、24、48 mg/ml三種濃度溶解于玉米油中，地芬諾酯組（低、中、高劑量組）每天早晨分別灌胃地芬諾酯12、24、48 mg/kg，連續7 d。對照組按同樣方法給予生理鹽水。第8天上午處死大鼠，取肝組織保存于-80℃冰箱。

樣品提取和衍生化方法：稱取100 g冷凍肝組織，加入預冷250 μl乙腈沉淀蛋白[10]。然后使用SCIENTZ-48組織磨機研磨2 min，研磨參數為64 Hz，1800 r/min。再將EP管渦旋混合1 min，冰浴15 min，4℃ 10 000 g離心10 min。取200 μl上清液真空冷凍干燥24 h。凍干粉在70 ℃下加入50 μl甲基羥胺鹽酸鹽（15 mg/ml，吡啶）1 h，然后加入50 μl MSTFA（以1% TMCS為催化劑），加入150 μl正庚烷后終止衍生化。

1.4數據處理和模式識別

對地芬諾酯組和對照組的肝組織進行GC-MS分析。信噪比>3的峰被采納。這些峰被放入NIST2010質譜數據庫中進行檢索。鑒定結果采取匹配度在70%以上的代謝物。為了補償樣品濃度的差異，對代謝物數據進行歸一化處理。采用獨立樣本t檢驗統計比較代謝物水平，找出不同的化合物。以P<0.05為差異有統計學意義。將標準化值導入SIMCA-P+11.0軟件（Umetrics，Umea，瑞典），采用PLS-DA多因素分析方法對地芬諾酯組與對照組進行分析。PLS-DA模型由三個參數（R2X，R2Y，Q2Y）來界定。計算參數R2和Q2，檢驗擬合優度和模型有效性。R2和Q2越接近1，表明該模型的有效性越高。

2結果

2.1各組大鼠肝組織的質譜分析

對32只大鼠肝組織樣品進行了基于質譜的代謝物譜分析，包括地芬諾酯組（低、中、高劑量組）和對照組，共觀察到60個質譜峰。

四組大鼠肝臟樣品的代表GC-MS圖譜如圖1（封三）所示。通過與NIST質譜數據庫中化合物的標準離子碎片的質荷比和豐度的比較，確定了它們的特征離子碎片譜。參考國外相關文獻NIST數據庫所提供的標準光譜圖[11-12]、化合物名稱、結構、分子式、分子量、匹配度和相似性等信息，對代謝產物進行了最終鑒定。化合物主要為氨基酸、脂肪酸、糖類、酯類、膽固醇等內源性代謝產物。

2.2各組大鼠肝組織代謝組學的分析

PLS-DA的得分圖顯示了四組的肝臟樣本散點分布，其中中劑量組大鼠點分布于低劑量組大鼠點中（圖2A，封三）。與PLS-DA相對應的載荷圖揭示了與得分圖對應的貢獻較大的代謝物（圖2B，封三）。置換試驗的驗證圖表明，地芬諾酯組和對照組的PLS-DA模型是有據的和可信的（圖2C，封三）。基于不同給藥濃度后肝臟GC-MS數據的PLS-DA軌跡如圖2D（封三）所示。

2.3大鼠肝組織代謝物相對水平的變化

為了進一步探索代謝產物，PLS-DA模型中第一主成分的重要度在各變量中的投影值（VIP>1），并結合t檢驗找出差異代謝產物。與對照組比較，地芬諾酯組肝組織中丁酸、丙酸、甘油、亮氨酸、甘氨酸、L-天冬氨酸、谷氨酰胺、木酮糖、赤蘚糖、9H-嘌呤、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、花生四烯酸肝組織代謝物水平均升高，而肌醇水平下降（P<0.05）（表1）。

3討論

大劑量服用地芬諾酯（40～60 mg/次）會產生欣快感，長期使用可致依賴性。人最小致死劑量為200 mg/kg。為探討地芬諾酯對大鼠的肝損傷過程，本研究比較了地芬諾酯組（低、中、高劑量組）和對照組的肝臟組織代謝組學差異。本研究中，丁酸、丙酸、9H-嘌呤、亮氨酸、甘氨酸和天冬氨酸是氨基酸代謝的產物，木酮糖、葡萄糖酸、D-甘露醇、半乳糖、甘油是能量代謝的中間產物。三羧酸循環（TCA）是三大營養素（碳水化合物、脂類、氨基酸）的最終代謝途徑，這些化合物的變化表明TCA的紊亂和機體代謝的異常[13-16]。TCA的中間產物是一些生物合成的前體，它們提供了能量代謝的主要來源，提供氨基酸合成的前體。在肝損傷演化過程中由于能量代謝受到擾動以及蛋白質降解的增加，改變了大鼠肝組織中自由氨基酸的濃度。因此，氨基酸濃度會隨著肝臟的不同狀態而改變。甘氨酸是肝臟線粒體中乙酰輔酶A的共軛氨基酸，其可以減輕肝臟細胞由于三磷酸腺苷（ATP）消耗引起的損傷。本研究中地芬諾酯組的甘氨酸含量升高，提示肝損傷過程中能量代謝受到擾動從而導致肝功能下降。另外地芬諾酯組大鼠肝組織中的亮氨酸、天冬氨酸升高，這與肝纖維化代謝組學研究結果一致[17]。其原因可能是由于肝損傷過程中擾動了蛋白質和氨基酸代謝的平衡。

肝臟作為能量代謝的重要器官之一，在機體碳水化合物和脂類代謝的調節中起著重要的作用。肌醇是半乳糖代謝的中間產物，地芬諾酯組肝組織中肌醇水平下降，提示肝功能損害。花生四烯酸是一種存在于細胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸，在大腦、肝臟和肌肉中含量豐富。地芬諾酯組大鼠肝組織中花生四烯酸含量的升高，與機體自身保護機制有關[18]。

綜上所述，通過基于GC-MS的代謝組學方法研究地芬諾酯給藥后的大鼠肝組織代謝物變化，結果顯示，對照組和給藥組代謝物完全不同。這些代謝物與氨基酸代謝、脂類代謝和能量代謝有關。該研究為更好地了解地芬諾酯及其類似物在肝組織中的代謝機制提供了依據。

[參考文獻]

[1]韓詠霞.小兒慎用復方地芬諾酯[J].醫藥與保健，2005，13（6）：47.

[2]黃軍軍，榮右明，李榮成，等.甘肅省強制戒毒者復方地芬諾酯濫用現狀及相關因素分析[J].中華流行病學雜志，2018， 39（9）：1222-1227.

[3]王達平，胡文生，丁毅，等.復方地芬諾酯片依賴11例臨床分析[J].中國藥物依賴性雜志，2009，18（5）：397-400.

[4]劉濤，周悅，楊子浩.復方地芬諾酯中毒的監護與護理[C].//中華醫學會.中華醫學會急診醫學分會第十六次全國急診醫學學術年會論文集.2013：551-552.

[5]王靜，袁子民，孔宏偉，等.基于氣相色譜-質譜聯用的代謝組學用于黃連治療Ⅱ型糖尿病的機理探索[J].色譜，2012， 30（1）：8-13.

[6]王洋，孫梅.基于氣相色譜-質譜聯用技術對嬰兒肝炎綜合征的代謝組學研究[J].國際兒科學雜志，2018，45（7）：537-542.

[7]俸家富.代謝組學技術在腎臟疾病診療中的發展[J].中華檢驗醫學雜志，2018，41（3）：246-250.

[8]崔艷艷，張彥婷，張璐玉，等.基于氣相色譜-質譜聯用技術的食管鱗癌細胞代謝組學分析[J].鄭州大學學報（醫學版），2019，54（4）：485-488.

[9]Wen CC，Zhang ML，Zhang Y，et al.Brain metabolomics in rats after administration of ketamine[J].Biomed Chromatogra，2016，30（1）：81-84.

[10]Waterman D，Horsfield B，Leistner F，et al.Quantification of polycyclic aromatic hydrocarbons in the NIST standard reference material （SRM1649A） urban dust using thermal desorption GC/MS[J].Anal Chem，2000，72（15）：3563-3567.

[11]Zhang M，Deng M，Ma J，et al.An evaluation of acute hydrogen sulfide poisoning in rats through serum metabolomics based on gas chromatography-mass spectrometry[J].Chem Pharm Bull（Tokyo），2014，62（6）：505-507.

[12]Craig A，Cloarec O，Holmes E，et al.Scaling and normalization effects in NMR spectroscopic metabonomic data sets[J].Ana Chem，2006，78（7）：2262-2267.

[13]Sublette ME，Galfalvy HC，Fuchs D，et al.Plasma kynurenine levels are elevated in suicide attempters with major depressive disorder[J].Brain Behav Immu，2011，25（6）：1272-1278.

[14]Schuster CR.History and current perspectives on the use of drug formulations to decrease the abuse of prescription drugs[J].Drug Alcohol Depend，2006，83 Suppl 1：S8-S14.

[15]Doerr A.Global metabolomics[J].Nat Methods，2017，14（1）：32.

[16]Allen EL，Ulanet DB，Pirman D，et al.Differential aspartate usage identifies a subset of cancer cells particularly dependent on OGDH[J].Cell Rep，2016，17（3）：876-890.

[17]Vila L，Rebollo A，Adalsteisson GS，et al.Reduction of liver fructokinase expression and improved hepatic inflammation and metabolism in liquid fructose-fed rats after atorvastatin treatment[J].Toxicol Appl Pharmacol，2011，251（1）：32-40.

[18]Levine L.Nuclear receptor agonists stimulate release of arachidonic acid from rat liver cells[J].Prostag Leukotr Ess，2002，67（6）：453-459.

（收稿日期：2020-01-21? 本文編輯：任秀蘭）