人乳頭瘤病毒E6/E7基因在宮頸癌發(fā)展過程中作用機制的研究

李明秀　劉志強　許振　楊世慧

[摘要]目前，宮頸癌仍是全球范圍內女性最常見的生殖系統惡性腫瘤，其中90%宮頸癌患者伴有人乳頭瘤病毒（HPV）的感染，以高危型HPV 16和18型為主。高危型HPV E6/E7基因是造成細胞永生化和腫瘤進展的主要原因，病毒基因組整合到宿主基因組是癌基因E6和E7致癌的關鍵步驟，大量研究證實E6和E7基因可以導致p53和pRb兩個重要的抑癌基因失活，而最新的研究表明這兩種基因可以作用于更多的細胞因子，如細胞的甲基化狀態(tài)、PI3K-AKT通路、基質金屬蛋白酶（MMPs）、白細胞介素-18（IL-18）等，對這些因子的不同影響最終導致了癌癥的發(fā)生、轉移及免疫逃逸等。

[關鍵詞]E6/E7;人乳頭瘤病毒;宮頸癌;PI3K-AKT;甲基化;基質金屬蛋白酶;免疫機制

[中圖分類號] R711? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）6（a）-0023-05

[Abstract] At present， cervical cancer is still the most common reproductive system malignant tumor in women worldwide， and 90% of patients with cervical cancer are infected with Human papillomavirus （HPV）， among which high-risk HPV types 16 and 18 are the main types. High-risk HPV E6/E7 gene is the main cause of cell immortalization and tumor progression. The integration of the viral genome into the host genome is a key step for oncogenes E6 and E7. A large number of studies have confirmed that E6 and E7 genes can lead to the inactivation of two important tumor suppressor genes， like p53 and pRb， the latest researches have shown these two genes can act on more cytokines， such as cell methylation status， PI3K AKT pathway， matrix metalloproteinases （MMPs）， and interleukin-18 （IL-18）， and different effect on these factors ultimately lead to the occurrence， metastasis and immune escape of cancer.

[Key words] E6/E7; Human papillomavirus; Cervical cancer; PI3K-AKT; Methylation; Matrix metalloproteinase; Immune mechanism

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種屬雙鏈閉環(huán)的球形小DNA病毒，在惡性腫瘤中，HR-HPV DNA首先與宿主細胞內的染色體整合，然后表達病毒E6、E7癌基因轉錄形成E6/E7 mRNA，進一步翻譯形成E6、E7蛋白，E6和E7蛋白可以降解pRb蛋白使宿主細胞進入S期，使病毒不斷復制，同時E6蛋白可以降解p53蛋白，逃避凋亡，使細胞分裂不受控制，導致基因組不穩(wěn)定的發(fā)生，這為腫瘤的發(fā)生提供了前提條件，其表達水平與宮頸病變的進展程度及細胞的惡性轉化關系十分密切。本文主要從以下4個方面介紹HPV E6/E7基因在宮頸癌發(fā)展過程中的作用機制。

1 E6/E7蛋白調節(jié)甲基化狀態(tài)

癌癥是由許多因素引起的疾病，近期研究發(fā)現表觀遺傳學是其中一個主要因素，通過改變細胞微環(huán)境在癌癥發(fā)展中起重要作用。DNA甲基化是用于修飾基因功能的表觀遺傳機制之一，不改變細胞的核苷酸序列[1]。研究表明，HPV感染細胞與細胞基因啟動子高甲基化密切相關，并抑制其轉錄[2-3]。在感染HPV的細胞中觀察到位點特異性甲基化的現象，其中87%的位點位于甲基化可變位置（MVP）的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CPG），該位點顯示病毒陽性的細胞甲基化增加。有研究者用人角質形成細胞轉染E6/E7基因后進行甲基化特異性檢測，其數字核型分析顯示，有34個基因顯示甲基化增加，同時基因表達下降[4]，這進一步驗證了E6/E7蛋白可調節(jié)細胞甲基化狀態(tài)，干預細胞基因正常轉錄。其中，E-鈣粘蛋白參與上皮中病毒的檢測，是HPV功能上重要的甲基化靶點，它與其他刺激信號協調朗格漢斯細胞通過上皮細胞的運動，從而增強宿主免疫系統的刺激來清除生物體中的病毒。在HPV感染的細胞中，E-鈣粘蛋白表達較低減少了朗格漢斯細胞的遷移，從而降低了上皮細胞的病毒清除率。然而，E6和E7都能通過DNA甲基轉移酶1（DNMT1）的活動下調E-鈣粘蛋白，而且E6的過度表達可導致E-鈣粘蛋白表達降低以及DNMT活性增加。相關研究表明，在高危型HPV感染細胞中，E6癌蛋白主要通過降解p53來增加DNMT1的表達和活性。E7調控DNMT1的過程分為兩種途徑，在間接機制中，E7與pRb結合并釋放一種存在于DNMT1的轉錄起始位點的轉錄因子，從而激活DNMT1的啟動子;在直接機制中，E7直接與DNMT1結合，導致DNMT1的構象變化，并暴露活性位點，使E7/DNMT1與DNA的結合，在E7與復合物解離后形成穩(wěn)定的DNMT1/DNA復合物，由于腫瘤抑制基因的沉默，這導致基因組的甲基化，并導致宮頸癌的發(fā)生[5]。另外，E7和DNMT1對細胞周期調節(jié)蛋白A1即細胞周期素A1（CCNA1）基因的啟動子有直接作用，這種相互作用已經在體外通過芯片實驗得到了驗證，實驗結果顯示，E7和DNMT1均位于CCNA1啟動子上，導致CCNA1的表達受到抑制[6]。通過這個發(fā)現，有研究提出利用CCNA1的甲基化狀態(tài)作為一個潛在的區(qū)分正常宮頸、低級別和高級別鱗狀上皮內病變的生物標志物[7]。趨化因子CXCL14也被鑒定為E7的甲基化靶點，其參與調控體內許多生物學過程，如炎癥反應、腫瘤的血管生成、腫瘤的特異性免疫激活以及腫瘤的自分泌調節(jié)等，E7蛋白作用于CXCL14的啟動子并形成高甲基化狀態(tài)，導致其抑制腫瘤血管生成的功能失活，進一步促進腫瘤的生長[3]。總之，E6/E7蛋白通過誘導DNMT的表達，導致異常的DNA甲基化和正常表觀遺傳過程的破壞，進而使調節(jié)細胞周期、參與細胞凋亡和粘附的基因表達水平發(fā)生改變，最終走向腫瘤的結局[6]。

2激活磷脂酰肌醇三激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路

近年來，PI3K-AKT途徑已被多次證明其在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用，尤其是與HPV相關的癌癥，該通路通過改變其靶基因的表達來實現多種細胞和分子功能，包括細胞生長和增殖、代謝、凋亡、遷移、侵蝕及血管生成等[8]，這些調節(jié)關系到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和結局，因此這條道路已被提議作為許多癌癥（包括宮頸癌）有希望的治療靶標。其中，PI3K通過調節(jié)不同的信號通路，促進細胞增殖、存活，防止細胞凋亡，是腫瘤發(fā)展的加速劑[9]。而AKT的磷酸化通過刺激AKT的催化活性，導致靶基因的磷酸化，產生一系列的生物學行為，如細胞的增殖、動員、存活以及血管的生成和抗凋亡能力，最終導致腫瘤進一步發(fā)展與轉移，甚至產生耐藥性[10]，影響患者預后。研究表明，E6/E7蛋白可通過多種細胞及分子事件激活PI3K-AKT通路，從而導致癌癥的發(fā)生[11]。E6蛋白還可通過上調PI3K激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路以促進細胞的增殖，且PI3K的活性在MAPK通路的不同水平都發(fā)揮著重要的誘導作用，E6蛋白通過PI3K間接作用于MAPK通路來調節(jié)細胞活動。研究發(fā)現[12]，鈉氫交換調節(jié)因子1（NHERF-1）是一種分子途徑組織者，其在細胞過程中發(fā)揮著信號轉導、細胞轉化和細胞募集，細胞質和細胞骨架信號蛋白轉化為功能復合物等作用。E6蛋白主要通過降解NHERF-1、激活PI3K-AKT通路這兩種重要途徑在腫瘤形成的過程中發(fā)揮作用，而E7蛋白可以激活細胞周期蛋白依賴性激酶復合物進一步促進E6蛋白對NHERF-1的降解。研究發(fā)現，蘇氨酸308位點和絲氨酸473位點的磷酸化是E7蛋白激活AKT的關鍵位點，隨后AKT的激活作用于相關死亡啟動因子（BAD）并使其磷酸化，減少了與Bcl-xl和Bcl-2的結合，阻止細胞色素C釋放入胞漿，從而抑制細胞凋亡。另外，E7蛋白也可以通過結合和隔離已知的結合配體來維持AKT基因處于活躍狀態(tài)，從而抑制AKT基因的去磷酸化，活躍的AKT基因激活MDM2癌基因，增加p53降解并導致pRb失活，進一步加強已建立的E6/E7對p53和pRb功能的影響[13-14]。據報道，蛋白磷酸酶2（PP2A）屬于絲氨酸蘇氨酸磷酸酶，其與P-AKT的35 kDa催化和65 kDa結構亞基相互作用，導致AKT的磷酸化，干擾細胞凋亡過程。此外，HPV E7蛋白與兩個PP2A亞基結合，以防止它們與P-AKT相互作用，從而維持AKT通路的激活。E6、E7蛋白通過激活PI3K-AKT通路并使AKT通路處于活躍狀態(tài)，誘導了細胞的永生化并逃避免疫監(jiān)視，是致癌的關鍵通路，而且該研究表明，腫瘤細胞中高表達AKT2能降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，導致腫瘤細胞耐藥[15]。

3上調基質金屬蛋白酶（MMPs）促進腫瘤轉移

MMPs是鋅依賴性蛋白酶家族之一，其通過破壞細胞外基質促進腫瘤細胞的遷移和轉移。目前MMPs家族的26個成員中，MMP-2和MMP-9多與患者預后不良相關。腫瘤細胞在致癌基因激活后合成MMP，從而使抑癌蛋白失活，刺激生長因子或炎癥介質的生成以及活性氧的產生和/或缺氧的存在，它們作用于細胞表面分子，影響細胞之間或細胞與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）之間的粘附（如鈣粘蛋白或整聯蛋白），從而使腫瘤細胞與相鄰細胞和ECM分離，在腫瘤進展中發(fā)揮重要的作用。其次，MMPs降解基底膜和ECM，為癌細胞運動和組織侵襲做準備[16]。而且研究發(fā)現MMPs允許癌細胞到達局部血液或淋巴管并穿透其壁，進而導致血行轉移及淋巴轉移，在小血管腔中，癌細胞通過MMP動作進入血管壁，并且在逃脫免疫監(jiān)視的情況下，產生繼發(fā)性腫瘤[17]。有研究發(fā)現，MMP成員中的MMP-9，MMP-2和MT1-MMP在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，它們的RNA或蛋白質表達在正常子宮頸和低級CIN中極低或不存在，在高級CIN及宮頸癌患者中表達量很高，此外，這些MMP的表達與高級CIN及宮頸癌患者中腫瘤血管密度成正相關[18]。MMPS在宮頸病變過程中離不開E6或E7蛋白的調節(jié)，在正常或轉化的上皮細胞中，致癌的E6或E7蛋白下調TIMP和/或上調MMP-2，MMP-9或MT1-MMP表達，從而增加上皮細胞的侵襲力，因此，宮頸癌患者血漿中MMP-9、MMP-2或MT1-MMP的含量與預后不良和腫瘤分期較高相關[19]，而這些現象與E6和E7蛋白對絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT通路的激活有一定的相關性[20]。綜上所述，磷酸化的AKT可以促進MMPs基因表達，即E6和E7蛋白激活AKT通路使其磷酸化，又進一步促進了MMPs基因的表達，增加了腫瘤細胞的遷移和轉移。

4通過白細胞介素-18（IL-18）逃避免疫監(jiān)視

IL-18是一種中性粒細胞趨化因子，由單核細胞產生，主要負責調節(jié)細胞增生及ECM的生成。細胞免疫是抗腫瘤的主要免疫方式，IL-18通過刺激Thl和Th2細胞增殖，并增強NK細胞和Thl細胞的細胞毒作用，促進T細胞的增殖，因此在抗腫瘤的免疫過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，Thl和Th2的比例失衡與腫瘤的發(fā)生、轉移及復發(fā)密切相關[21]。為了進一步證明E6及E7基因對IL-18的作用，Cho等[22]通過細胞轉染的方法使HaCAT（正常角質形成細胞系）和C-33A（HPV陰性宮頸癌細胞系）穩(wěn)定表達E6、E7蛋白，通過RT-PCR檢測各細胞系中IL-18的表達，結果顯示，E6的表達與IL-18的表達成負相關，同時發(fā)現在表達E6基因的C-33A細胞系中p53基因表達顯著下降，而E7在兩細胞系中均未顯著影響IL-18的表達。共轉染實驗表明，E6癌基因不直接抑制IL-18啟動子P1和P2的活性，而是通過間接途徑抑制IL-18表達，并抑制IL-18受體活化后的下游聯級效應，使機體不能及時通過細胞免疫消滅病變細胞，導致突變細胞的增殖、擴散。另外研究發(fā)現，IL-18具有誘導產生干擾素-γ2的功能，干擾素-γ2具有抗病毒、免疫調節(jié)及抗腫瘤的特性，當機體持續(xù)感染HPV時，E6、E7蛋白通過間接抑制干擾素-γ2的產生來逃避免疫監(jiān)視，加快腫瘤的形成[23]。

5小結

綜上所述，HPV E6/E7可通過多種途徑導致宮頸癌，這些途徑之間并不是獨立的，而是相互作用共同導致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來，宮頸涂片作為宮頸癌的初步篩查方法，為廣大女性贏得了及時診治的機會，但宮頸細胞學的局限性和較高的假陽性率是開發(fā)新預防方法的充分理由[24]，且目前宮頸癌的治療方式仍以手術治療為主，術前的新輔助化療及術后化療仍不能有效預防宮頸癌的復發(fā)及轉移[25]。目前，已有大量研究開始從致癌機理上尋找突破口，探索預防和治療惡性腫瘤的新靶點，如DNA疫苗、基因治療及創(chuàng)新的RNA干擾技術（RNAi）等。RNAi是通過降解轉錄后mRNA或抑制其翻譯成蛋白質來阻斷目的基因的表達，沉默目的基因的表達是目前實驗較常用的實驗方法，該技術能否為今后的基因靶向治療提供有效的幫助仍需進一步探索。上文提到，DNA甲基化是癌基因表達最重要的表觀遺傳機制之一，這些表觀遺傳修飾涉及腫瘤進展，并且可能在某種程度上可用于未來的診斷[26]。另外，用DNMT抑制劑處理細胞會導致被抑制的基因重新表達并增加細胞對化療的敏感性，希望通過進一步研究可以將這一機理應用到預防宮頸癌復發(fā)與轉移的治療中[27]。近年來，PI3K-AKT抑制劑也成為宮頸癌治療研究的熱點，尤其是HPV感染患者，有研究發(fā)現AKT抑制劑在常氧條件下抑制HPV陽性癌細胞的增殖，結果表明，AKT抑制劑的抗增殖作用優(yōu)于來自E6/E7的促生長刺激作用[28]。另外，PI3K/AKT抑制劑具有免疫調節(jié)特性，其可通過降低免疫抑制細胞因子和趨化因子的表達以及抑制免疫調節(jié)細胞（如調節(jié)性T細胞或髓源抑制因子）的效應功能來增強腫瘤免疫監(jiān)視[29]。由于HPV陽性癌細胞的惡性生長依賴于病毒癌基因的連續(xù)表達，因此要更加深入地研究E6/E7基因的致癌機制，爭取找到預防和治療宮頸癌及其他相關惡性腫瘤的有效靶點。

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（收稿日期：2019-12-16? 本文編輯：任秀蘭）