染色體微陣列分析技術在胎兒頸項透明層增厚中的應用

丁小瑞 劉愛菊 楊曉彥 張俊繪

[摘要] 染色體微陣列分析（CMA）是新近發展的產前診斷技術，憑著巨大的優勢得到了廣泛的應用。其優點為分辨率達到Kb級別、靈敏度和特異性高、較高程度的自動化操作以及高效率等，不僅能檢測染色體數目異常及非平衡性結構異常，還能檢測染色體組亞顯微結構水平上不平衡重排引起的拷貝數變異（CNV）。因此，在臨床檢測中取得青睞，成為現在臨床遺傳學常規診斷的工具，并被引入到產前胎兒遺傳疾病檢測中。頸項透明層（NT）測量作為常規的早孕期篩查項目之一已被人們廣泛采用，大量研究發現NT增厚是胎兒染色體異常的一項敏感性指標。CMA已作為產前診斷遺傳篩查的一線診斷技術，在超聲檢測出NT異常時，染色體異常的被檢出率，CMA較常規核型分析明顯增高，但CMA技術可否作為產前診斷的一線檢測方法目前尚不明確，在應用中特別要重視對臨床意義不明的基因CNV的解釋和遺傳咨詢。本文將對CMA技術在胎兒NT增厚中的應用、優勢和面臨的挑戰等作一個詳細的綜述。

[關鍵詞] 頸項透明層增厚;染色體微陣列分析技術;產前診斷

[中圖分類號] R714.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0045-05

Application of chromosome microarray analysis in thickening of transparent layer of fetal neck

DING Xiaorui1? ?LIU Aiju2▲? ?YANG Xiaoyan2? ?ZHANG Junhui2

1.Graduate School， Inner Mongolia Medical University， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010000， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Inner Mongolia Maternal and Child Health Hospital， Inner Mongolia Autonomous Region， Hohhot? ?010000， China

[Abstract] Chromosomal microarray analysis （CMA） is a newly developed prenatal diagnosis technology， which has been widely used due to its huge advantages. Its advantages are Kb level resolution， high sensitivity and specificity， high degree of automation and high efficiency etc.， it can not only detect chromosome number and unbalanced structural abnormalities， but also detect copy number variation （CNV） caused by unbalanced rearrangement at the level of chromosomal sub microstructure. Therefore， it has gained favor in clinical detection， become the tool of clinical genetic routine diagnosis， and has been introduced into prenatal fetal genetic disease detection. The measurement of nuchal translucency （NT） has been widely used as one of the routine screening items in early pregnancy. Many studies have found that NT thickening is a sensitive index of fetal chromosomal abnormalities. CMA has been used as a first-line diagnostic technique for prenatal genetic screening. In the detection rate of chromosomal abnormalities when NT abnormality is detected by ultrasound， CMA is significantly higher than that of conventional karyotype analysis. However， it is not clear whether CMA can be used as a first-line detection method for prenatal diagnosis. In application， it is necessary to pay special attention to the explanation and inheritance of gene CNV of clinical significance consultation. In this paper， we will review the application， advantages and challenges of microarray analysis in the thickening of NT.

[Key words] Thickening of nuchal transparent; Chromosome microarray analysis technique; Prenatal diagnosis

隨著國家“二孩”政策的放開，孕婦年齡和環境因素的影響，新生兒的出生缺陷率也隨之增加。新生兒的出生缺陷主要是由染色體異常引起的，不但影響出生人口質量，而且多數無法治愈。為了減少新生兒的先天缺陷導致的家庭和社會負擔，提高人口素質，產前診斷也在以迅猛的速度發展。研究[1-2]表明，頸項透明層（nuchal translucency，NT）增厚不僅是21-三體綜合征的重要標志，而且與其他染色體異常有關。因此，NT篩查已成為懷孕期間的常規檢查項目之一。核型分析G顯帶技術已應用40年，曾經一度被認為是染色體異常診斷的“標尺”，只有非整倍體染色體數和較大的結構異常才能被檢測出來，缺點是無法發現較小片段的異常，例如拷貝數變異（copy number variation，CNV），并且G顯帶技術材料受限，染色體亞端粒區域診斷率較低，培養時間長等，使得其作為產前診斷一線檢查的地位受到挑戰。自2004年染色體微陣列分析技術（chromosomal microarray analysis，CMA）應用于產前診斷以來，染色體檢出率顯著增高，逐漸得到廣泛應用。近年來有許多學者[3-6]對NT增厚染色體正常的胎兒進行CNVs分析，所獲得具有臨床意義的染色體微缺失/微重復檢出率為7.7%～8.3%。它可以確定異常片段的染色體核型的來源和性質，有效診斷染色體核型分析無法識別的較小片段，如染色體微缺失和微重復，從而提高染色體異常的檢測成功率和診斷率。

1 NT的闡述

1.1 NT的定義

NT的厚度是指胎兒正中矢狀切面，頸椎水平皮膚與結締組織之間的半透明軟組織的液體積聚的厚度，這是胎兒發育中的一種特殊聲象圖[7]反應在超聲圖上為胎兒頸部皮下組織中的無回聲帶。

1.2 NT增厚與胎兒染色體異常的關系

1.2.1 NT增厚與染色體核型異常的關系? 1990年，NT異常會導致出現21-三體綜合征被首次提出[8]。1992年Nicolaides等[9]選取827例病例進行研究，首次提出胎兒早孕期NT增厚是預測染色體異常的一個重要指標。Sun等[10]研究NT增厚與染色體異常的關系，118例病例中91.5%進行了侵入性核型分析，其中20例染色體核型是異常的，檢出率為18.5%。Yang等[11]對296例NT增厚的病例進行核型分析，顯示存在染色體異常的病例占19.9%。董媛等[12]研究的218例NT增厚的病例中，48例染色體異常，占總染色體異常的22.02%。劉偉明[13]研究156例NT增厚孕婦，檢出染色體異常27例，且隨著NT厚度的增加，核型異常發生率也增高。張春榮等[14]對61份NT增厚樣本研究，發現染色體異常11例，異常檢出率為18.0%。綜上表明，NT增厚與染色體核型異常有著明顯的關聯，可以作為產前診斷有創性篩查的依據。

1.2.2 NT增厚與染色體核型正常的關系? NT增厚，但染色體核型正常，胎兒出生缺陷的概率有多大呢？Bilardo等[15]回顧性總結，對于NT增厚但核型正常的胎兒，最終不良結果的發生率約是20%。侯莉等[16]研究NT增厚，419例胎兒行染色體核型分析，結果核型異常55例，核型正常的病例中出現自然流產或胚胎停育15例。事實上，染色體核型正常但發生不良結局的NT增厚胎兒的基因組可能發生了微小的不平衡畸變，其中微缺失和微重復是最常見的類型[17]。傳統的細胞遺傳學技術尚不能解決此問題，是臨床咨詢中的難點。因此，需要更加精細及準確的基因技術，來解決此類問題。

2 CMA技術

CMA技術又名“分子核型分析”，分為基于微陣列的比較基因組雜交aCGH技術和單核苷酸多態性SNP技術。aCGH芯片可以追蹤定位DNA拷貝數量變化及其在基因組的位置。SNP芯片能檢測出單親二倍體與三倍體，對SNP基因型進行分析，提高染色體改變在亞顯微層面上的分辨率和覆蓋率。因此結合二者，使其優勢最大程度地發揮，檢測出更多有意義的臨床病例。

2.1 CMA的優勢及缺點

更快和更早發現胎兒缺陷是產科領域的關注重點。當常規檢查檢測到可疑陽性體征時，需要醫院提供更精確的檢測。常用的染色體檢測有染色體核型分析、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、CMA等。最經典的方法是傳統的染色體G顯帶核型分析技術，其最主要的缺點是不能發現基因組CNVs。而FISH用于單細胞分析，一次只能對幾個或者一個候選位點進行檢測，而且不能檢測雜合子缺失（LOH）/單親二倍體（UPD）。FISH的最大缺陷在于檢測依賴探針，缺乏覆蓋全基因篩查的能力。近年來研究表明，針對染色體的拷貝數變異，CMA技術能對其進行精準檢測。CMA有如下優勢：分辨率更高，在核型分析中，大部分被研究出來的微缺失/微重復綜合征病變范圍為1.5～3.5 Mb，而CMA能夠發現0.1～0.3 Mb范圍的微缺失/微重復病變，廣泛應用于腫瘤、遺傳性疾病及產前診斷等多個領域[18-19];直觀準確性，明確追蹤定位DNA拷貝數量變化及其在基因組的位置;不需要細胞培養，可直接檢測血液、羊水和絨毛膜絨毛樣本;出報告速度更快，結果更加準確可靠，并且實驗的流程經過標準化處置，結果應用軟件系統分析，取代了主觀判斷，降低了人為誤差[20-21];利用高密度的單核苷酸芯片檢測基因組基因的多態性，鑒定LOH和UPD的分析;結合全基因擴增技術，可以進行胚胎全染色體組的檢測。但是，CMA也存在一定的缺點：不能檢測到染色體平衡性的結構改變級異位，不能檢測點突變以上的多倍體等。最為關鍵的是，隨著CMA技術的日新月異，凸顯了我們認識水平提高緩慢的缺陷，使得臨床意義不明拷貝數變異的出現，對結果的正確解讀及遺傳咨詢成為我們最嚴峻的挑戰[22]。

2.2 CMA在產前診斷中的應用

隨著臨床研究的發展，CMA應用于產前診斷一直在進行中，直至2009年，美國婦產科醫師學會首次提出把CMA技術應用于產前診斷中，但附帶說明：傳統的常規核型分析作為主要細胞遺傳學工具，CMA不能替代。2010年，CMA首次被細胞遺傳學確認為檢測先天性畸形或發育異常患者染色體突變的臨床診斷試驗[23]。2013年美國公布：如果超聲檢測發現胎兒結構異常，建議直接進行CMA檢測，取代傳統的染色體核型分析技術[24]。緊隨其后，我國在2014、2016年發布了CMA應用于產前診斷及兒科遺傳疾病的臨床應用[25-26]。這些指南的發布，提供了CMA在中國產前診斷中的指導方針及臨床地位。

2.3 CMA在NT增厚中的研究

早在2009年Law等[27]應用CMA技術在1例NT增厚但核型正常胎兒中檢出16p13.11微缺失，考慮該微缺失可能會導致自閉癥或智力發育遲緩。2011年Leung等[28]對NT增厚但核型正常的48例胎兒進行基于芯片的比較基因組雜交技術（aCGH）分析，4例證實為致病性CNVs。得出結論，在NT增厚且染色體核型分析正常的病例中應用CMA技術可以額外檢出更多的致病性CNVs。王敏等[29]利用染色體微陣列聯合核型分析對NT增厚胎兒的研究中，51例標本用SNP檢測，染色體異常有20例，其中染色體核型異常11例，得出NT異常的胎兒。采用染色體核型+染色體微陣列檢測，對檢測染色體微缺失微重復，具有重要的產前診斷意義。李志華[30]在其研究中表明隨著NT的增厚，CNV拷貝數變異發生率明顯升高，用aCGH技術可以明顯提高NT增厚胎兒的染色體異常檢出率。薛淑雅等[31]通過染色體微陣列CMA分析374例NT增厚病例，265例（70.9%）CMA結果正常，109例（29.1%）CMA結果顯示染色體異常，其中69例為常染色體數目異常，17例為性染色體數目異常，23例為拷貝數異常。由此可見，CMA技術在NT增厚的應用中，可以更多地檢出有臨床意義的致病性疾病，在產前診斷學科中具有重要可行性意義。

但是，也有一些學者提出相反的觀點。Schou等[32]聯合高分辨比較基因組雜交（HR-CGH）技術和多重連接依賴探針擴增（MLPA）技術對100例早孕期NT增厚但核型正常的胎兒進行分析，結果未能檢出致病性CNVs。因此認為NT增厚但核型正常胎兒中，HR-CGH和MLPA不能額外檢出致病性CNVs。Scott等[33]對90例NT增厚胎兒進行分析研究，結果在41例核型正常的胎兒中僅發現1例致病性CNVs。因此認為NT增厚與致病性CNVs無關。Huang等[34]對早孕期NT增厚但核型正常的215例活產病例進行分析，其中199例未見任何其他異常，結果僅在3例中檢出CNVs，且最終均考慮為臨床意義不明的染色體拷貝數變異（VOUS）。未檢出任何致病性CNVs，認為NT增厚可能與致病性CNVs無關，與傳統細胞遺傳學比較，aCGH并不能額外提高疾病檢出率。

2.4 CMA結果的解讀

2011年美國醫學遺傳學會發布了CNV解釋指南，建議采用5級報告系統，即致病性的、可能致病性的、不確定的、可能良性的或良性的。這5級報告系統中數據庫的不完善，給遺傳咨詢帶來相當大的挑戰，督促我們盡快提高認知水平，緩解認知與CMA技術快速發展形成的矛盾，推動CMA的發展。

總之，近30年的研究表明，“NT增厚”已被確定為胎兒結構異常的非特異性標志物，NT厚度與胎兒畸形的發生有直接關系。CMA是目前檢測CNV和多態性的最佳技術。結合NT增厚，CMA可以檢測到更多的染色體異常。但是CMA是否可以用于NT增厚、染色體異常的侵入性檢測，以及作為產前診斷的一線檢測，從2005年研究至今，只能認為CMA對微缺失/微重復的檢出率有重要意義，可以作為產前診斷的標準檢測，而不能得出結論作為一線檢測。這就需要我們進行更大樣本、更多中心、更長時間的研究來確保其在產前診斷中的地位。盡管CMA存在不足，如缺失或擴增的確切位置不能完全確定、低水平嵌合體的檢出率及最受爭議的VOUS的臨床意義不確定性等使其在產前診斷中面臨嚴峻挑戰。但不能否認，CMA對微缺失/微重復的檢出率，提高疾病的臨床診斷，提供新的診斷檢測方法。隨著我們對數據庫的不斷完善，對CMA結果的認知提高，逐漸發揮CMA的優勢，使其成為臨床一線檢測手段，造福于社會。

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