病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b表達檢測及臨床意義

魏從真 趙小潔 李彥明 柴越 邊策 趙帥

[摘要] 目的 檢測病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b的表達，并探討其臨床意義。 方法 回顧性分析2016年6月～2019年6月河北醫科大學第一醫院（以下簡稱“我院）收治的62例病毒性腦炎患兒的臨床資料和同期在我院體檢的43名健康兒童的資料，分別記為研究組和對照組。根據感染病毒類型將研究組進一步分為研究A組（單純皰疹病毒7例）、研究B組（帶狀皰疹病毒9例）、研究C組（腸道病毒28例）、研究D組（腮腺病毒6例）、研究E組（流行性乙型病毒12例）5個亞組。比較研究組、對照組及研究組各亞組中輕型和重型的miR-146a、miR-146b水平;比較研究組和對照組T淋巴細胞亞群水平，分析研究組外周血miR-146a、miR-146b與T淋巴細胞亞群的相關性，比較不同預后患兒外周血miR-146a、miR-146b水平。 結果 不同研究組亞組和研究組miR-146a、miR-146b均高于對照組（P < 0.05），且重型患兒均高于輕型患兒（P < 0.05）;不同研究組和研究組亞組CD+3、CD+4及CD+4/CD+8均低于對照組（P < 0.05），而CD+8均高于對照組（P < 0.05）;不同研究組和研究組亞組miR-146a、miR-146b與CD+3、CD+4、及CD+4/CD+8均呈負相關（P < 0.05），與CD+8均呈正相關（P < 0.05）;研究組預后不良率為17.74%，預后不良患兒miR-146a、miR-146b均高于預后良好者（P < 0.05）。結論 病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b的表達水平均升高，能夠反映病情并與T淋巴細胞亞群具有相關性，且可以預測預后情況。

[關鍵詞] 病毒性腦炎;miR-146a;miR-146b;T淋巴細胞亞群

[中圖分類號] R512.3? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0096-05

Detection of peripheral blood miR-146a and miR-146b levels in children with viral encephalitis and their clinical significance

WEI Congzhen? ?ZHAO Xiaojie? ?LI Yanming? ?CHAI Yue? ?BIAN Ce? ?ZHAO Shuai▲

The First Clinical Laboratory， the First Hospital of Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang? ?050000， China

[Abstract] Objective To detect the peripheral blood miR-146a and miR-146b levels in children with viral encephalitis， and to explore their clinical significance. Methods Clinical data of 62 children with viral encephalitis admitted to the First Hospital of Hebei Medical University （“our hospital” for short） from June 2016 to June 2019 and the physical examination data of 43 healthy subjects during the same period in our hospital were retrospectively analyzed， and they were recored as study group and control group respectively. The study group was further divided into 5 subgroups according to the virus type： study group A （7 cases of herpes simplex virus）， study group B （9 cases of herpes zoster virus）， study group C （28 cases of enterovirus）， study group D （6 cases of parotid virus）， and study group E （12 cases of epidemic virus B）. The levels of miR-146a and miR-146b between the study group， the control group and mild and severe cases of subgroups of study group were compared. The levels of T lymphocyte sub-population were compared between the study group and the control group. The correlations between the levels of miR-146a and miR-146b in peripheral blood and T lymphocyte sub-population levels in study group were analyzed. The levels of miR-146a and miR-146b in peripheral blood of different prognosis were compared. Results The levels of miR-146a and miR-146b in the study group and different sub-groups of the study group were higher than those in the control group （P < 0.05）， of which the severe cases were higher than the mild cases （P < 0.05）. The CD+3， CD+4 and CD+4/CD+8 in the study group and different sub-groups of the study group were lower than the control group （P < 0.05）， while the CD+8 levels were higher than the control group （P < 0.05）. The levels of miR-146a and miR-146b of the study group and different sub-groups of the study group were negatively correlated with CD+3， CD+4， and CD+4/CD+8 （P < 0.05）， which were positively correlated with CD+8 （P < 0.05）. The levels of miR-146a and miR-146b in children with good prognosis were significantly lower than those with poor prognosis （P < 0.05）. Conclusion The levels of miR-146a and miR-146b in children with viral encephalitis increase， which can reflect the severity of the conditions and have correlations with the T lymphocyte sub-population， which can predict the prognosis.

[Key words] Viral encephalitis; miR-146a; miR-146b; T-lymphocyte sub-population

病毒性腦炎是指腦實質有病毒直接入侵而引起的原發性腦炎[1]。據統計，病毒性腦炎的死亡率為60%～80%[2]。病毒性腦炎早期癥狀呈現多樣性，導致臨床誤診或者漏診的概率較大。miR-146a、miR-146b與人類多種疾病密切相關，可反映機體的炎性反應情況和免疫功能[3]。研究證實，miR-146a、miR-146b可參與炎性反應和免疫反應等，可能與病毒性腦炎的發生和發展有關[4]。鑒于此，本研究特設計回顧性分析，探討病毒性腦炎患兒中miR-146a、miR-146b表達水平的臨床價值和意義，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016年6月～2019年6月河北醫科大學第一醫院（以下簡稱“我院”）收治的62例病毒性腦炎患兒的臨床資料和同期在我院體檢的43名健康兒童的資料，分別作為研究組和對照組。其中研究組男41例，女21例;年齡6個月～11歲，平均（6.41±1.23）歲;感染病毒類型：單純皰疹病毒7例，帶狀皰疹病毒9例，腸道病毒28例，腮腺病毒6例，流行性乙型病毒12例，分別記為研究A組（輕型4例、重型3例），研究B組（輕型5例、重型4例），研究C組（輕型18例、重型10例），研究D組（輕型4例、重型2例），研究E組（輕型8例、重型4例）。輕型患兒39例，其中男26例，女13例;年齡6個月～10歲，平均（6.42±1.22）歲。重型患兒23例，男15例，女8例;年齡8個月～11歲，平均（6.38±1.24）歲。對照組男28名，女15名;年齡8個月～12歲，平均（6.61±1.36）歲。研究組和對照組性別、年齡比較，差異均無統計學意義（χ2=0.475，P = 0.526;t = 0.698，P = 0.302），重型組和輕型組性別、年齡比較，差異無統計學意義（χ2=0.396，P = 0.621;t = 0.742，P = 0.228）。本研究已經我院醫學倫理委員會批準。

研究組納入標準，①符合病毒性腦炎診斷標準[5]：急性或亞急性發病，多伴有發熱，有明確腦實質損害表現，腦脊液檢查可呈非化膿性改變，提倡與中心實驗室協作進行病毒病因學檢查明確感染的病毒類型，多數患兒腦電圖主要表現為背景節律顯著慢化，呈彌漫性，且頭顱CT或MRI檢查可見腦水腫，大多無其他異常，部分病情嚴重的患兒可顯示炎性病灶形成界限不清、大小不等、不規則的低密度或高密度影，若為單純皰疹病毒感染易侵犯顳葉等且可出現局灶性病變及相應表現，若大腦皮層廣泛重度損害，腦電圖可出現？簟波，腦脊液檢查可見異常但也有少數患兒腦脊液完全正常;②初診患兒;③予以對癥治療，且有完整的資料信息。排除標準：①細菌性腦膜炎者;②結核性腦膜炎者;③伴其他免疫或者感染性疾病者;④惡性腫瘤者;④既往神經功能缺損史者。

1.2方法

1.2.1 外周血miR-146a、miR-146b檢測? 兩組均采取外周靜脈血6 mL，研究組于入院當天采血，對照組于體檢當天采血，3500 r/min離心10 min，離心半徑：12.5 cm，提取血清，置于-70℃冰箱保存備測。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測兩組研究對象外周血miR-146a、miR-146b表達水平。用移液槍取血清加入細胞裂解液，用總RNA提取試劑盒（Invitrogen，美國，生產批號：151211 001A）提取RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA純度，采用逆轉錄試劑盒（Fermentas，美國，生產批號：151215BRNA）將總RNA進行逆轉錄，以U6為內參，具體操作按照試劑盒說明書進行。miR-146a上游引物：5′-AGAGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3′，下游引物：5′-ACCCTGTAGATCCGAATTTGTGTAA-3′;miR-146b上游引物：5′-GAGCGGAGTTTACGTGATCGTAGCT-3′，下游引物：5′-GTAGCTGATGCTAGCTAGATAGCTA-3′。反應體系：2×miR Premix（含SYBR和ROX）10 μL+上下游引物各0.4 μL+miR cDNA 5 μL+50×ROX reference dye 1.6 μL，最后向其中加入ddH2O，整個反應體系共20 μL。PCR反應條件：95℃ 10 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，74℃延伸30 s，連續進行40次循環，每個樣品均設3個平行反應孔。采用2-ΔΔCt法進行miR-146a、miR-146b的相對定量分析。

1.2.2 研究組病情判斷? 按有無意識改變或癲癇發作或出現神經系統定位體征，分為輕型和重型[6]。輕型：僅有一般腦病特征;重型：出現昏迷或癲癇發作或神經定位系統體征。

1.2.3 T淋巴細胞亞群檢測? 兩組均采取外周靜脈血5 mL，研究組于入院當天采血，對照組于體檢當天采血，3000 r/min離心10 min，離心半徑8.0 cm，加入CD3、CD4和CD8單抗（購自美國貝克曼庫爾特公司，生產批號：160412001A、160409003A、160420008C），并加入T4-FITC單抗（購自美國貝克曼庫爾特公司，生產批號：160407002B），采用流式細胞儀（Epics XL型，美國貝克曼庫爾特公司）檢測，并利用儀器自帶軟件分析血清T淋巴細胞亞群CD+3、CD+4、CD+8占比，計算CD+4/CD+8。

1.2.4 研究組預后判斷方法? 統計研究組預后不良情況發生率，參考文獻[7]將癲癇、精神異常、持續性頭痛、癱瘓或死亡記為預后不良。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，若不符合正態分布需首先進行正態性轉化，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Pearson相關性分析法。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血miR-146a、miR-146b水平比較

研究組及其各亞組外周血miR-146a、miR-146b水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.2不同病情患兒miR-146a、miR-146b水平比較

研究組及其各亞組中，重型患兒外周血miR-146a、miR-146b水平均高于輕型，差異均有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 兩組T淋巴細胞水平比較

研究組及其各亞組CD+3、CD+4、以及CD+4/CD+8值均低于對照組，差異均有統計學意義（P < 0.05），且CD+8比例高于對照組（P < 0.05），且研究組各亞組中T淋巴細胞亞群水平比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）。見表3。

2.4 研究組miR-146a和miR-146b水平與T淋巴細胞亞群的相關性分析

研究組及其各亞組患兒miR-146a、miR-146b水平與CD+3、CD+4水平及CD+4/CD+8呈負相關（P < 0.05），與CD+8呈正相關（P < 0.05）。見表4。

2.5 不同預后患兒miR-146a、miR-146b水平比較

治療2周后，5例患兒精神智力障礙，3例患兒癲癇，2例患兒癱瘓，1例患兒死亡，共有11例患兒預后不良，其中研究A、B、C、D、E組分別有1、1、6、1、2例預后不良，預后不良率為17.74%。研究組及其各亞組中，預后不良患兒miR-146a、miR-146b水平均高于預后良好患兒，差異均無統計學意義（P < 0.05）。見表5。

3 討論

病毒性腦炎致死率極高，可損傷機體免疫功能[8]。病毒沖破血腦屏障入侵腦實質可引發腦部廣泛性的中樞神經系統病變[9]。有研究報道，細胞及細胞因子在發病過程中起重要作用，miR-146家族（miR-146a、miR-146b）與細胞生長、增殖、分化、凋亡以及機體免疫活動密切相關[10]。因此探討外周血miR-146a、miR-146b在病毒性腦炎患兒中的表達及意義有重要作用。

本研究結果中，研究組和不同類型病毒感染患兒外周血miR-146a、miR-146b水平均高于對照組，提示病毒性腦炎患兒外周血miR-146a、miR-146b表達水平升高，且不同類型病毒感染患兒外周血miR-146a、miR-146b水平均高于健康兒童。miR-146a、miR-146b均可迅速誘導和促進炎性反應，還可抑制核因子（NF）-κB活化，影響機體免疫[11]。當機體受到炎癥刺激時，宿主細胞中的miR-146a、miR-146b被激活，其水平升高，并誘發炎性反應和免疫應激[12]。本研究結果顯示，重型組miR-146a、miR-146b表達水平均高于輕型組，提示病毒性腦炎外周血miR-146a、miR-146b與病情相關，且在不同類型病毒感染患兒中均表現出該趨勢。有研究報道，病毒性腦炎機體中的單核細胞、中性粒細胞以及多種免疫細胞可由于受到感染刺激產生大量炎癥介質，加重病情[13]，而miR-146a、miR-146b可引起機體代償性炎性反應[14]，因此其水平與病情相關。

本研究結果還顯示，研究組和不同類型病毒感染患兒CD+3、CD+4、CD+4/CD+8均低于對照組，且CD+8均高于對照組，提示病毒性腦炎患兒的T淋巴細胞亞群發生紊亂，免疫功能減低，且不同類型病毒感染患兒T淋巴細胞亞群指標均有異常。機體內CD+3細胞反映細胞免疫功能狀態，CD+4是輔助性T淋巴細胞，CD+4/CD+8反映機體炎性反應和免疫平衡的狀態，CD+8主要是抑制機體免疫反應，患兒發生病毒性腦炎時，前三者水平降低，后者水平升高，說明機體的免疫功能失調[15-16]。一旦病毒性腦炎發病，miR-146a、miR-146b升高，致使黏附到腦血管外皮細胞中的T細胞和初級T細胞減少，進而影響T淋巴細胞和血-腦脊液屏障的功能，導致免疫調節失衡[17]。本研究結果還發現，研究組及不同類型病毒感染患兒外周血miR-146a和miR-146b表達水平與CD+3、CD+4水平及CD+4/CD+8均呈負相關，與CD+8均呈正相關，提示miR-146a和miR-146b表達水平可以反映免疫功能指標。有研究顯示[18]，miR-146a和miR-146b表達水平與機體的免疫功能呈現負相關，可用于反映機體的免疫功能。

此外本研究發現，預后不良患兒miR-146a、miR-146b水平均高于預后良好者，提示二者可能與病毒性腦炎患兒的預后有關。病毒感染后，機體內miR-146a、miR-146b水平過高可引發代償性炎性反應[19]，導致病情加重，并且二者還可促進淋巴細胞增殖和生長，影響免疫應答反應，進而加重病情[20]，因此可影響預后。

綜上，外周血miR-146a、miR-146b參與病毒性腦炎的發病及發展過程，可以作為反映病毒性腦炎患兒病情和機體免疫功能的重要指標，且二者水平越高患兒預后不良的風險很可能也越高。本研究的不足在于受病毒類型檢驗難度大、病例少等限制所選樣本量稍少，可能造成結果偏倚，后期應擴大樣本量進一步探討。

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（收稿日期：2020-01-08? 本文編輯：任? ?念）