GSK-3β表達水平與膠質瘤患者預后的關系

趙凱 王志武 楊俊泉

[摘要] 目的 分析糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表達水平與膠質瘤患者預后的關系。 方法 收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民醫院接收手術治療膠質瘤148患者的組織標本和臨床病理資料。根據GSK-3β表達水平將其分為GSK-3β高表達組（85例）和GSK-3β低表達組（63例）。收集兩組年齡、性別、腫瘤長徑（<4 cm，≥4 cm），腫瘤位置（額葉、顳葉、其他），WHO分級資料，免疫組化檢測GSK-3β在組織中的表達，Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析GSK-3β表達與膠質瘤患者的預后關系。 結果 GSK-3β表達水平與WHO分級明顯相關（P < 0.05）。GSK-3β高表達組的總生存時間短于GSK-3β低表達組（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）。GSK-3β高表達、WHO高分級是預后不良的影響因素。結論 GSK-3β高表達與膠質瘤患者的不良預后有關，是其不良預后的獨立預測因子。

[關鍵詞] 膠質瘤;糖原合成酶激酶-3β;預后;免疫組化

[中圖分類號] R739.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0113-04

Relationship between GSK-3β and prognosis in patients with glioma

ZHAO Kai? ?WANG Zhiwu? ?YANG Junquan

The First Department of Chemoradiotherapy， Tangshan People′s Hospital， Hebei Province， Tangshan? ?063000， China

[Abstract] Objective To analyze the relationship between glycogen synthase kinase-3β （GSK-3β） expression and prognosis of glioma patients. Methods Tissue specimens and clinical pathological data of 148 cases who received surgical treatment for glioma in Tangshan People′s Hospital of Hebei Province from January 2010 to December 2014 were collected. According to the expression of GSK-3β， they were devided into GSK-3β high-expression group （85 cases） and GSK-3β low-expression group （63 cases）. Age， gender， tumor length and diameter （<4 cm， ≥4 cm）， tumor location （frontal lobe， temporal lobe， others）， WHO grading data of two groups were collected. Immunohistochemical analysis of GSK-3β expression in tissues， Kaplan-Meier analysis and Cox regression analysis of the relationship between GSK-3β expression and the prognosis of glioma patients. Results GSK-3β expression level was significantly correlated with WHO grade （P < 0.05）. The total survival time of GSK-3β high-expression group was shorter than that of GSK-3β low-expression group （HR=2.31， 95%CI： 1.87-4.15， P < 0.01）. High GSK-3β expression and WHO grade were the factors affecting poor prognosis. Conclusion The high expression of GSK-3β is related to the poor prognosis of glioma patients， and it is an independent predictor of poor prognosis.

[Key words] Glioma; Glycogen synthetase kinase-3β; Prognosis; Immunohistochemistry

膠質瘤是成人原發性腦腫瘤中最具侵襲性的類型，包括星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、少突-星形膠質瘤細胞和室管膜瘤[1]。膠質瘤又可分為WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ級，級別越高，惡性程度越高;對于WHO Ⅳ級膠質瘤患者，中位生存時間只有12～15個月，對于Ⅲ級和低級別（Ⅰ和Ⅱ級）膠質瘤患者，生存期雖然可超過兩年，但因為其具有高度侵襲性和對治療的抵抗，預后也不盡如意[2-3]。盡管臨床實踐中已經運用多種策略，包括通過預測工具、分子和遺傳信息來輔助膠質瘤的診治管理，但腫瘤進展和復發風險仍然是一個重要問題。近5年來，膠質瘤的治療方法有所改進，但患者的中位生存率并不令人滿意。因此，有必要探索新的癌癥相關基因，來作為膠質瘤治療預后標志物[4]。

糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是一種多功能的Ser/Thr激酶，包括α和β兩種亞型，最初被認為是糖原代謝和胰島素信號轉導的關鍵介質[5]。GSK-3β是其亞型之一，在多種信號通路起核心作用，如Wnt/β-catenin和Akt等[6-7]。GSK-3β的失調也與腫瘤發生和發展有關，如前列腺癌、胃癌和食管癌等[8]。Zhao等[9]研究發現，GSK-3β可以調節mTOR/p70S6K1信號通路，抑制神經膠質瘤的進展。然而，GSK-3β的表達情況在神經膠質瘤中臨床意義尚不明確。本研究分析了GSK-3β表達與膠質瘤預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2014年12月河北省唐山市人民醫院（以下簡稱“我院”）接收手術治療的腦膠質瘤患者。納入標準：①術后病理證實為腦膠質瘤，②病歷資料且隨訪信息完整;③患者了解本研究并簽署知情同意書。排除標準：①患有高血壓、糖尿病、冠心病等慢性疾病，肺炎、肝炎和肺結核等急慢性感染者;②術前接受過放化療或患有其他惡性腫瘤者。本研究共納入研究對象148例，平均年齡（56.0±9.8）歲，其中男67例，女81例。本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

本研究所用標本均來自我院腦外科術后的組織標本。因研究為回顧性研究，實驗開始時所有患者均已完成病理相關診斷，術后組織標本均已包埋于石蠟中儲存。免疫組織化學檢測，神經膠質組織包埋在石蠟中，然后在4 μm切片機上進行切片。切片放置在載玻片上，在不同的時間段里使用不同濃度的酒精溶液（75%、80%、90%、95%、100%）脫水，使用二甲苯進行清洗。本研究采用兩步間接免疫組化染色法。將針對人GSK-3β的兔抗體（Solarbio公司，貨號：K000492P，生產批號：20180804）分別稀釋至1∶200和1∶250。抗體染色后，4℃過夜。采用過氧化物酶偶聯二抗與3，3′-二氨基苯并苯胺（DAB）底物-染色原反應，用于福爾馬林固定石蠟包埋組織切片。在切片上與DAB反應可在抗原部位產生不溶于乙醇和二甲苯的棕色產物。切片用磷酸緩沖鹽溶液（北京中杉金橋公司，貨號：ZLI-9062，生產批號：20190102）沖洗3次，然后應用光學顯微鏡以200倍的放大率觀察組織中靶蛋白的表達。隨機選擇5個高倍視野，計數500個細胞，并計算免疫組化的細胞占總細胞數的百分比，百分比≥50%為高表達，<50%為低表達，根據GSK-3β表達水平將其分為GSK-3β高表達組和GSK-3β低表達組。

1.3 觀察指標

收集受試者年齡、性別、腫瘤長徑（<4 cm，≥4 cm），腫瘤位置（額葉、顳葉、其他），WHO分級（Ⅰ/Ⅱ，Ⅲ/Ⅳ），其中腫瘤長徑、位置、WHO分級分組統計的分組方法參考經典文獻[9-10];觀察GSK-3β表達水平與預后的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗;計數資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗;采用多因素Kaplan-Meier和cox回歸進行相關性分析，以P < 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 腦膠質瘤患者一般資料及臨床病理參數與GSK-3β表達水平的關系

兩組年齡、性別、腫瘤長徑、腫瘤位置比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。兩組卡氏功能狀態評分（KPS）比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;GSK-3β表達水平與腫瘤WHO分級有關（P < 0.05）。

2.2 GSK-3β表達與膠質瘤患者預后的關系

GSK-3β高表達組的總生存時間短于GSK-3β低表達組（HR=2.31，95%CI：1.87～4.15，P < 0.01）;Ⅲ/Ⅳ級預后比Ⅰ/Ⅱ級更差（HR=1.34，95%CI：1.21～2.69，P < 0.05）。多因素Cox回歸分析提示，GSK-3β高表達、WHO高分級是預后不良的影響因素。見圖1、表2。

3 討論

近年來盡管在手術、放療和化療方面取得了進展，但膠質瘤患者的預后仍然較差。膠質瘤患者尤其是膠質母細胞瘤患者的1、3、5年相對生存率分別低于30%、5%、3%[14]。因此，尋找并確認膠質瘤的預后因子對提高膠質瘤患者的預后和治療至關重要。分子水平的標志物在多種不同癌癥類型的檢測和治療中發揮重要作用，包括各種腦部疾病[11]。Cheng等[12]結果顯示，PAX6作為miR-335的新靶點，在膠質瘤中具有抗癌作用，推測PAX6可能作為治療膠質瘤的靶點。本研究嘗試探討GSK-3β在判斷腦膠質瘤中的預后作用。

局部浸潤性生長和血管生成是膠質瘤的主要特征，因此，腫瘤增殖、侵襲、及血管生成的分子標志物均有可能是膠質瘤的預后因子。GSK-3β最初被認為是糖原合成酶激酶的限速酶，之后研究提示GSK-3β除在糖代謝中起作用外，其生物學作用尚與腫瘤的増殖、侵襲、調亡及血管生成等過程密切相關[8]。最近的研究[13]顯示，GSK-3β是一個腫瘤抑制組分的相關分子之一，因為其在腫瘤中可以直接磷酸化β-catenin蛋白，執行靶向降解。研究顯示，GSK-3β在多種人類癌癥中存在特異性表達[14]，如Wang等[15]認為SOX9 mRNA的過表達與惡性膠質瘤患者臨床預后不良密切相關，靶向SOX9可能是一種新的治療策略。GSK-3β在膠質瘤中的作用有較多的基礎研究[16]，Miyashita等[17]比較了23例膠質瘤組織和癌旁組織樣本中的GSK-3β表達水平的差異，發現腫瘤組織較周圍正常組織的GSK-3β表達水平更高而靶向GSK-3β的特異性小分子抑制劑可減弱膠質瘤細胞的増殖能力，促進其凋亡。Zhao等[9]在體外研究中分別應用GSK-3β抑制劑或RNAi干擾技術抑制GSK-3β的表達，膠質瘤細胞的增殖和侵襲增強，同時其凋亡率減低。Yang等[18]揭示GSK-3β是通過磷酸化53BP1誘導膠質母細胞瘤細胞核中的DNA DSB修復，有可能是增強放療敏感性的治療靶點。Zhou等[19]研究發現，GSK-3β促進組蛋白脫甲基酶KDM1A的累積，并在腫瘤發生過程中調節組蛋白H3K4甲基化，導致癌癥干細胞自我更新和膠質母細胞瘤的發生。此外，GSK3抑制劑Tideglusib使小鼠移植瘤對化療敏感性增強，并提高其生存率[7，19-20]。

然而，GSK-3β在神經膠質瘤患者的臨床作用尚不清楚。在目前的研究中，本研究調查了GSK-3β表達與沒有接受放化療的膠質瘤患者預后的關系，發現GSK-3β高表達與膠質瘤患者的不良預后有關。GSK-3β的表達明顯受到WHO分級的影響，GSK-3β可能參與神經膠質瘤的發生和發展。Kaplan-Meier生存分析顯示，GSK-3β高表達組的總生存時間短于GSK-3β低表達組（P < 0.05），提示GSK-3β表達對神經膠質瘤患者的預后相關。多因素生存分析進一步證實GSK-3β高表達與不良預后的關系，提示GSK-3β高表達可能是一個獨立的預后指標。

本研究尚存在一些局限性，首先本研究為回顧性研究，不可避免的會出現相關的研究偏倚，該結果尚需前瞻性研究來進一步證實。另外本研究為單中心的研究，樣本量有限，這需要多中心的研究來進行下一步的確證性研究。

總之，本研究發現GSK-3β高表達與膠質瘤患者的不良預后有關，是其不良預后的獨立預測因子，將來應該進一步研究其分子機制，開發以其為靶點的靶向藥物。

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（收稿日期：2019-12-06? 本文編輯：劉明玉）