精養草魚池塘底泥微生物群落結構分析

章海鑫，付輝云，張燕萍，張愛芳，陶志英，王 生，余智杰

( 江西省水產科學研究所，江西 南昌 330039 )

目前，草魚(Ctenopharyngodonidellus)精養池塘水體一般為封閉或半封閉，養殖密度高、投喂量大，水體營養鹽的利用率不高，僅有少量餌料能被草魚吸收利用，殘餌、排泄物與殘骸等則通過物理、化學和生物作用逐漸沉降到水底淤泥中[1]。養殖水體與外界交換很少，沉積的營養鹽主要靠自身消解，此能力直接決定了沉積營養鹽的存在形式及其對養殖草魚和環境的影響程度[2]。參與底泥沉積營養鹽作用的底泥微生態系統扮演著重要的角色，不僅參與養殖系統中有機質、無機鹽等物質的循環代謝及能量代謝，也影響養殖動物消化系統微生物菌群結構[3]。底泥微生態系統的演替一直貫穿于整個群落發展的始終。微生物具有較短的代時且對環境變化較為敏感，所以在池塘養殖過程中，底泥微生物群落結構的變化能夠及時反映環境的變化，并且影響水產品的質量[4]。因此，可以通過探明微生物群落之間的演替關系來評估和判斷養殖環境的變化。

草魚養殖池塘底泥微生物群落的研究已有很多，如程瑩寅等[3]用16S rDNA克隆文庫的方法分析主養草魚池塘底泥微生物群落結構，Han等[5]使

用同樣的方法分析混養有草魚、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)和團頭魴(Megalobramaamblycephala)的池塘底泥中微生物的主要群落結構和優勢種群。以上兩種養殖模式下，池塘底泥微生物主要是變形菌門、厚壁菌門和分類地位未定的種類。此外，唐凌等[4]分析了不同年份草魚池塘底泥群落結構，也從養殖模式上分析了成都平原主養草魚并搭配鯽魚(Carassiusauratus)池塘底泥中細菌的群落結構[6]；張植強等[7]則使用PCR-DGGE技術分析了草魚和烏鱧(Channaargus)養殖圍隔中沉積物的微生物群落結構。以上這些研究均使用16S rDNA克隆文庫和PCR-DGGE技術分析底泥群落結構，而且均為一次性的分析底泥微生物群落結構，并未分析底泥微生物群落在時間維度上的變化。但在草魚養殖周期中，環境會發生一定的變化，影響底泥的微生物群落結構。因此，分析草魚養殖池塘底泥微生物群落結構隨養殖時間的變化情況對指導草魚養殖和分析微生態系統的生態作用有重要的意義。筆者利用MiSeq測序技術逐月分析草魚養殖池塘底泥微生物群落結構，以期查明草魚養殖過程中底泥微生物群落的變化情況和池

塘底泥生態的變化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 池塘養殖信息

樣品采集池塘為南昌市南昌縣蔣巷鎮同一養殖戶、同樣養殖模式[套養彭澤鯽(C.auratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)]的3口草魚精養池塘，均投喂全價配合飼料(表1)。

表1 池塘養殖情況

1.1.2 樣品采集

2018年4—11月，每月采集樣品。表層底泥樣品(約200 g)用彼得森采泥器采集，暫時保存在干冰采樣箱中，24 h內帶回實驗室，于冰箱-80 ℃保存。

1.2 DNA提取、擴增和測序

分別稱取每月平行的3口池塘的底泥0.5 g，用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit，D5625)提取，提取后混合為1個樣。16S rRNA基因V3～V4區擴增引物為：341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠檢測后，利用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的條帶。然后使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(Illumina)進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量, 用HiSeq2500(北京諾禾致源公司)測序。

1.3 數據處理與分析

1.3.1 序列處理

參照文獻[8]的方法，采用Illumina HiSeq測序平臺得到原始數據，然后進行拼接和質控，得到有效數據，再進行嵌合體過濾，得到可用于后續分析的有效數據。然后基于有效數據進行運算分類單元(OTUs)聚類。

1.3.2 統計分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效數據進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成運算分類單元。根據運算分類單元聚類結果對每個運算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息。根據物種注釋結果，選取每個樣品在門和種2個分類級別上最大豐度前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。對所有樣品的運算分類單元進行豐度分析、Alpha多樣性分析等，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息等。使用QIIME軟件(Version 1.7.0)計算Alpha多樣性指數，包括ACE 指數、Chao1指數等豐富度指數。選用ANOSIM統計分析方法檢驗分組樣品的物種組成和群落結果的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 測序結果與多樣性分析

樣品原始序列為53 276～71 351條，得到最終的有效數據序列為47 743～65 233條，可歸納為14 027～21 098個運算分類單元(表2)。

表2 數據和運算分類單元數目統計

樣品序列多樣性分析結果見表3。物種豐富度指數ACE和chao1指數分別為8602.39～18 313.78和8471.27～17 863.10，5月最高，11月其次，10月和9月最低，其余月差別不大。物種數高峰出現在5月和11月，物種數低峰出現在10月和9月。10月和9月Shannon指數最低，5月最高，其次分別為4、6、7、11、8月等。綜上，4、5、6月多樣性高于其余月份。

2.2 菌群結構分析

8個月的樣品中檢測到的微生物歸屬見表4。5月細菌總數最豐富，歸屬于60個門、148個綱、293個目、390個科、551個屬。10月細菌總數最少，歸屬于54個門、124個綱、251個目、328個科、398個屬。其余月介于兩者之間。

表4 4—11月樣品中檢測到門、綱、目、科、屬的種類數

主要門為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、Nitrospinae、藍細菌門、螺旋體門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、疣微菌門、廣古菌門12門類，在4—11月的樣品檢測量均超過1%，5、7、9月還有Patescibacteria，檢測量超過1%，10月和11月藍細菌門檢測量不超過1%，但10月梭桿菌門超過1%，而11月Latescibacteria超過1%。其余未超過1%的門主要是棒狀桿菌門、迷蹤菌門、Calditrichaeota、芽單胞菌門、纖維桿菌門、紫細菌門和Dependentiae等。在優勢門(豐度超過10%)中，變形菌門是所有樣品中最大的優勢菌群，豐度均超過了35%。綠彎菌門和擬桿菌門是4、7月的優勢菌群，擬桿菌門和酸桿菌門是5月的優勢菌群，擬桿菌門、綠彎菌門和酸桿菌門是6月的優勢菌群，酸桿菌門是8月的優勢菌群，綠彎菌門和酸桿菌門是9—11月的優勢菌群。其他是未能確定門的和門分類比例較少的門(圖1)。ANOSIM檢驗結果表明，底泥月間差異不顯著(P>0.05)，微生物群落結構組成大體相同，只有少量細菌在數量上存在較小差別。月份間菌群在種類和數量方面存在一定差異，但整體結構差異不顯著。

圖1 樣品中基于門水平的菌群相對豐度分析

2.3 微生物種結構組成

樣品中豐度最高的10個運算分類單元代表了主要微生物類型。4—11月樣品中10個最高運算分類單元代表的種(屬)見表5。地桿菌(Geobacter)、Desulfatiglans、Candidatuscompetibacter和厭氧粘細菌(Anaeromyxobacter)在4—11月的樣品中均有存在，且豐度大。除10月外，脫氯單胞菌(Dechloromonas)、螺旋體(Spirochaeta-2)和Crenothrix在其他月樣品中豐度均在前10。其中地桿菌在4、5、6、7月的樣品中豐度均最大，8、9、10、11月豐度波動變化。Desulfatiglans在4—9月是一個豐度逐漸上升的過程，8、9月豐度最大，后開始下降，11月又最大。10月豐度前10菌種組成與其他月的差別較大，豐度最大的是C.competibacter。脫氯單胞菌、螺旋體在其他月中有，但在10月豐度未超過10%。

表5 4—11月樣品豐度最高的10個運算分類單元

3 討 論

3.1 池塘底泥菌群結構月度變化

雖然ANOSIM檢驗得出底泥月間微生物群落結構差異不顯著(P>0.05)，而且張植強等[7]在草魚圍隔沉積物中也得到菌落結構變化不顯著的結果；同樣Zhou等[9]認為，池塘底泥微生物群落結構穩定的原因是有機物的沉積量超過了池塘的凈化能力。但本研究發現，ACE和Chao1指數月度差異較大，Shannon指數也有一定的差異，這與史麗娜等[10,12]的結果類似，茍小蘭等[11]同樣得到異育銀鯽養殖池塘多樣性存在月度變化的情況，說明草魚池塘底泥微生物群落處于動態演替過程。唐凌等[4]發現，池塘經養殖4年后微生物菌群結構發生了演替，而本研究未發現群落結構月度間的顯著性差異，可能是演化的時間不長。同樣，由本研究各月樣品優勢門組成的變化也可以看到微生物群落的緩慢演替現象；雖然各月最大優勢類群與程瑩寅等[3,13]報導的一致，均為變形菌門，但本研究中各月除了變形菌門外，其他優勢門的構成存在差異。茍小蘭等[11-12]的試驗得到了底泥豐富度指數和多樣性指數會隨著時間的推移而降低的結論，而本試驗中所得結果是豐富度指數和多樣性指數存在波動變化的趨勢，并在10月降至最低，11月有升高。原因可能除分析方法差異外，養殖過程中飼料投喂的增加—降低過程，也會導致對菌群結構定向馴化由弱到強再變弱的過程。

(續表5)

3.2 菌屬對草魚底泥生態的影響

豐富度最高的10個運算分類單元有助于了解樣品中所含的主要微生物類型。一般認為，在有機物含量豐富的水體中，變形菌門，特別是δ-變形菌類群的數量增多[14]，而本研究中豐富度最高的10個運算分類單元均來源于變形菌門，這可能是大多高密度養殖池塘底泥微生物優勢種均為變形菌門的原因。4—7月地桿菌豐度最高，8—11月則是脫硫酸鹽橡菌豐度最高。地桿菌屬于δ-變形桿菌綱，是最早發現的可以完全氧化有機物并獲得能量用于生長的異化鐵還原菌之一，廣泛存在于各種厭氧環境中，可以利用Fe(Ⅲ)和乙酸作為電子供體[15-16]。Moon等[17]認為，有機物的積累能刺激地桿菌大量富集。說明殘餌、排泄等使得池塘底泥有機物在4—7月持續遞增，而且池塘底部存在溶解氧缺少的問題。8月以后地桿菌豐度出現波動的原因之一可能是生物(草魚等)擾動使Fe(Ⅲ)反復活化[15]。同時也發現有另一種呼吸性鐵還原菌——厭氧粘細菌[18]在所有樣品中均有出現，它與地桿菌對氧化鐵的利用具有差別，其能夠偶聯乙酸鹽氧化，進行還原鐵礦的呼吸代謝。地桿菌和厭氧粘細菌均能夠在厭氧條件下抑制甲烷產生[15-18]，這也可以解釋許多草魚養殖池塘在缺氧時，底部時常產生氣泡，但慢慢氣泡會減少的現象。隨著養殖殘餌和排泄物等有機物的大量增加，底泥硫化物的含量也增加，所以8—11月樣品中Desulfatiglans豐度高于地桿菌。Desulfatiglans是Suzuki[19]于2014年分離的一種與脫硫小桿菌(Desulfobacterium)緊密聯系，但又與脫硫小桿菌屬中其他種明顯不同的新種，其主要功能是通過硫酸鹽還原的方式脫除硫酸鹽[20]。自8月開始，Desulfatiglans的豐度超過地桿菌，一度豐度最高，說明硫化物的累積量達到高峰，這也間接解釋了許多養殖池塘在養殖中后期容易出現硫化氫的現象。在4—9月豐度較高的脫氯單胞菌和Crenothrix在10月樣品中豐度未進前10，而10月豐度最高的是C.competibacter。脫氯單胞菌屬于兼性反硝化細菌，可以在有氧和無氧條件下礦化各種單環芳香化合物，將苯轉化成二氧化碳[21],還具有反硝化除磷的功能[22-24]；Crenothrix則是2017年[25]新分離的一種能夠氧化甲烷的細菌，屬于兼性細菌，可以在有氧和無氧條件下將甲烷氧化成二氧化碳，也具有減少硝酸鹽向亞硝酸鹽轉化的功能。由此可知，10月草魚養殖池底泥中芳香族化合物及甲烷的產生得到一定的控制或者減少。而此時磷的含量累計到最高，所以C.competibacter處于領先優勢，因其屬于聚糖菌，主要使用碳源除磷，在厭氧條件下將揮發性脂肪酸轉化成聚羥基脂肪酸，在有氧條件下可以將聚羥基脂肪酸氧化成二氧化碳或轉化成糖原[26]。