水產動物源細菌質粒介導的喹諾酮類耐藥研究概況

吳甘林，鄧玉婷，姜 蘭，譚愛萍，趙 飛，張瑞泉

( 1.中國水產科學研究院 珠江水產研究所，農業農村部漁用藥物創制重點實驗室，廣東省免疫技術重點實驗室，廣東 廣州 510380； 2.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 201306； 3.農業部水產品質量安全控制重點實驗室，北京 100141 )

喹諾酮類藥物是一種人工合成的抗菌藥物，這類抗菌藥都有喹諾酮環結構，又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類。喹諾酮類藥物能夠穿透細胞壁進入細胞直接作用于DNA促旋酶(拓撲異構酶Ⅱ)和拓撲異構酶Ⅳ[1]，通過抑制這兩種酶而阻斷DNA的復制，從而發揮抗菌作用[2]。由于這類藥物擁有抗菌譜廣、高效、用藥量低、給藥方便、毒副作用低和與其他抗菌藥物不產生交叉耐藥等優點[3]，廣泛應用于人醫臨床、畜牧水產養殖的細菌病治療中。目前喹諾酮類藥物主要用于治療水產養殖動物常見病原如氣單胞菌(Aeromonas)、弧菌(Vibrio)等引起的細菌性疾病[4]。其中第三代氟喹諾酮類藥物恩諾沙星是我國水產批準使用的動物專用藥物[5]，由于其在水產動物體內的半衰期長、分布廣、吸收好及廣譜抗菌等特性而被廣泛應用于水產養殖動物感染性疾病的預防和治療[6]。另外，諾氟沙星也是水產養殖上廣泛使用的藥物之一[6]，除了單方給藥外，常與鹽酸小檗堿成復方預混劑使用[5]。由于氟喹諾酮類藥物在畜牧水產養殖的廣泛應用，耐藥性問題也越趨嚴重，為了減少該類藥物可能對養殖業、人體健康造成危害或者潛在風險，農業部自2016年開始禁止將洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種氟喹諾酮類藥物用于食品動物養殖[7]。

近年來，隨著喹諾酮類藥物長期、大量、廣泛使用，導致人類、動物及環境細菌喹諾酮類耐藥性不斷增強[8]。細菌對喹諾酮類藥物的耐藥機理主要有基因突變、膜對藥物的通透性改變、外排泵及質粒介導的喹諾酮類耐藥[1]。基因突變主要是改變藥物的作用靶位，突變發生后藥物丟失作用靶位而產生耐藥[9]。膜通透性改變及外排泵的存在可以使細胞質內的藥物含量下降，藥物的抗菌活性便會降低[10]。在質粒介導的喹諾酮類耐藥被發現之前人們一直認為細菌對喹諾酮類藥物耐藥主要由染色體上的靶基因突變和細胞膜通透性改變所致，而近年來科學家們陸續發現了各種質粒介導的喹諾酮類耐藥(PMQR)機制。由于質粒介導的喹諾酮類耐藥基因大多位于可移動接合質粒上，可通過整合子、轉座子、插入序列等耐藥元件進行耐藥基因交換，從而加快喹諾酮類耐藥性在細菌之間的傳播。

隨著水產動物源細菌喹諾酮類耐藥性的日益嚴重，因此有必要開展水產動物源細菌喹諾酮類耐藥性的調查和加強質粒介導的喹諾酮類耐藥基因分子傳播機制研究，為減少喹諾酮類耐藥菌的產生和傳播提供理論依據。筆者將從質粒介導的喹諾酮類耐藥機制、水產動物源細菌對喹諾酮類藥物耐藥狀況及質粒介導的喹諾酮類耐藥基因的流行分布等方面進行綜述，以期引起人們對水產養殖中細菌耐藥性的重視，也為科研工作者對水產養殖中細菌對喹諾酮類藥物耐藥性的產生、流行及其傳播途徑的研究提供一定的研究思路。

1 質粒介導喹諾酮類耐藥機制

質粒介導的喹諾酮類耐藥基因一般分為三大類，第一類是qnr基因及其不同的等位基因，包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qnrVC基因，第二類是能降低環丙沙星活性的氨基糖苷乙酰轉移酶變異基因aac(6′)-Ib-cr，第三類是外排泵基因qepA和oqxAB[11]。

1.1 qnr基因

qnr基因在1998年由美國學者Martínez等[12]首次報道，該基因發現于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的一個耐藥質粒pMG252上。qnr基因編碼五肽重復氨基酸序列五肽重復家族Qnr蛋白，由于后續發現新的變體，qnr被重新命名為qnrA和qnrA1，后續又有qnrB、qnrS、qnrC和qnrD等一系列質粒介導的喹諾酮耐藥基因的報道。最近，一種新的qnr家族——qnrVC基因也陸續被報道，qnrVC基因最早在霍亂弧菌(Vibriocholerae)中檢出[13]，主要在海產品、水環境及腹瀉病人分離的弧菌中流行[14-16]，Qnr蛋白的作用機制是通過保護DNA促旋酶和拓撲異構酶Ⅳ不受藥物的抑制，避免促旋酶、喹諾酮類藥物和DNA三者形成穩定的復合物，進而導致喹諾酮類藥物失效[17-18]。Martínez等[12]發現，攜帶了qnr基因質粒的菌株其染色體自發突變的頻率增加了100倍，表明攜帶了qnr基因的質粒可以促進菌株染色體突變從而導致高水平喹諾酮類耐藥的產生。

1.2 aac(6′)-Ib-cr基因

2006年，美國學者Robicsek等[19]發現，氨基糖苷乙酰轉移酶Aac(6′)-Ib發生了兩處氨基酸的突變，即Trp102Arg和Asp179Tyr，該突變引起大腸桿菌(Escherichiacoli)對環丙沙星的敏感性下降，因此將該突變體命名為Aac(6′)-Ib-cr，其中“-cr”表示環丙沙星耐藥。aac(6′)-Ib-cr基因編碼的滅活酶其作用位點是哌嗪環上的氨基氮“NH”，所以只乙酰化喹諾酮類藥物中含有哌嗪環的環丙沙星和諾氟沙星，從而降低細菌對該藥物的敏感性[20]。據報道，aac(6′)-Ib-cr基因多位于多重耐藥質粒的整合子上，少量位于染色體上，因此也將其歸為質粒介導的喹諾酮類耐藥機制[12]；aac(6′)-Ib-cr單獨存在時引起細菌對環丙沙星的最小抑菌濃度增加了3～4倍，比qnr基因介導的低，且對萘啶酸、左氧氟沙星等哌嗪環上的氨基已被甲基取代的喹諾酮類藥物不起作用[19]。由于該基因編碼的滅活酶可以同時介導氨基糖苷類和喹諾酮類耐藥，體現了細菌在抗菌藥物選擇壓力下的強適應能力[11]。

1.3 qepA基因

喹諾酮類外排泵(qepA)是日本學者Yamane等[21]在2002年自住院病人尿液分離的大腸桿菌中發現的。qepA由14個跨膜區511個氨基酸組成，是一種質子依賴型的外排泵蛋白，類似于環境放線菌的主要易化超家族(MFS)，可以降低對親水性氟喹諾酮類藥物如環丙沙星、諾氟沙星的敏感性。qepA基因檢出的報道較少，主要見于腸桿菌科，如大腸桿菌，也有在其他革蘭氏陰性菌上發現[11]。研究表明，IS26和ISCR3C耐藥元件有助于質粒上的qepA基因的傳播[11]。

1.4 oqxAB基因

oqxAB作為一種多重藥物外排泵，屬于耐藥結節分化超家族(RND)外排泵，最初與用于豬的促生長劑喹乙醇有關[22]。oqxAB基因具有廣泛的底物特異性，僅對氯霉素、甲氧芐啶、環丙沙星、諾氟沙星及萘啶酸具有敏感性[22]。由于它可以降低細菌對喹諾酮類藥物的敏感性，且多位于耐藥質粒上，后被歸入質粒介導的喹諾酮類耐藥機制家族[23]。oqxAB基因也主要在革蘭氏陰性菌檢出，廣泛存在于大腸桿菌中，尤其是動物源腸桿菌科細菌檢出率較高[24]。oqxAB基因兩端通常都含有IS26-like序列，該元件促進了oqxAB基因在菌株中的廣泛傳播[24]。

2 我國水產動物源細菌對喹諾酮類藥物耐藥狀況

目前雖然只認為質粒介導的喹諾酮類耐藥基因只引起低水平耐藥(菌株對喹諾酮類藥物的敏感性下降，但最小抑菌濃度值未達到耐藥折點)，但質粒介導的喹諾酮類耐藥基因的存在可促進其他喹諾酮類耐藥機制如靶位基因突變、外排機制的發生，有助于菌株產生喹諾酮類藥物高水平耐藥(其最小抑菌濃度值高于耐藥折點)[23]。隨著喹諾酮類藥物在水產養殖中的大量使用，水產動物源細菌不可避免地產生了喹諾酮類耐藥。喹諾酮類耐藥菌的出現范圍正在擴大，世界各地均不同程度地分離到相關耐藥菌。目前，國內外學者已在各種水產動物病原菌如氣單胞菌、弧菌、鏈球菌(Streptococcus)、愛德華氏菌(Edwardsiella)，水產品食源性細菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonella)等中檢測到喹諾酮類耐藥。

關于喹諾酮類藥物的耐藥研究顯示，不同科屬細菌對各種喹諾酮類藥物的耐藥情況各有差異，不同地域、不同養殖品種對于喹諾酮藥類物耐藥情況也有不同。研究發現，在患病水產動物上分離的病原菌對氟喹諾酮類的耐藥率為5%～80%，不同科屬的病原菌耐藥率差異較大。呂小麗等[25]采用紙片擴散法對分離自廣西地區發病尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的30株無乳鏈球菌(S.agalactiae)進行藥物敏感性測定，結果顯示，分離菌株對不同喹諾酮類藥物的耐藥率差異較大，對依諾沙星的耐藥率最高，為80%，對諾氟沙星的耐藥率也達到40%，而對環丙沙星、氧氟沙星和左氟沙星的耐藥率均低于10%，對恩諾沙星和鹽酸沙拉沙星完全敏感。丁正峰等[26]于2006—2009年期間收集江蘇省境內480株水產病原菌進行菌種鑒定及耐藥率統計，其中弗尼斯弧菌(V.furniss)對4種氟喹諾酮類藥物(諾氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星和環丙沙星)的耐藥率為20%～50%，嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)為45%～70%，類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)為65%～85%。林居純等[27]采用紙片擴散法對分離自不同患病水產動物體內的120株嗜水氣單胞菌進行藥物敏感性測定，結果顯示，對諾氟沙星、環丙沙星和氧氟沙星的耐藥率分別為55%、40%和39%。譚愛萍等[28]將分離自廣東地區患病龜鱉的67株氣單胞菌同樣采用K-B紙片法測定其藥物敏感性，結果表明，此67株龜鱉源氣單胞菌對4種喹諾酮類藥物環丙沙星、諾氟沙星、恩諾沙星和氧氟沙星的耐藥率分別為19.40%、22.39%、41.79%和52.24%。Deng等[29]對分離自患病水產動物的106株氣單胞菌進行藥物敏感性測定，結果表明，龜鱉類、觀賞魚源的分離株對喹諾酮類藥物的耐藥情況較養殖魚類和蝦類的嚴重。由此可見，一些經濟價值較高、養殖密度較大或工廠化養殖的品種如龜鱉類、特色經濟魚類、觀賞魚等其分離的病原菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率比大宗淡水養殖魚類、養殖蝦類等的高，其耐藥率可達60%以上，這可能與在這些品種養殖周期長、用藥頻繁等有關。

在喹諾酮類耐藥性研究中還發現，水產品中分離的食源性細菌及在無發病情況下采集的水產動物、養殖環境樣品分離菌對氟喹諾酮類的耐藥率均偏低(10%以下)。付溥博等[30]采用藥敏紙片擴散法對進出口水產品中分離的320株副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)進行藥敏測試，受試菌對萘啶酸、吡哌酸和諾氟沙星3種喹諾酮藥物的耐藥率均不超過3%。Jiang等[31]采用瓊脂稀釋法測定了市場采集分離的魚源大腸桿菌的敏感性，結果顯示，只有4.1%的菌株對環丙沙星耐藥。劉穎等[32]對46株金黃色葡萄球菌水產品分離株進行藥敏試驗，結果顯示，受試菌對環丙沙星的耐藥率為4.3%。馮永永等[33]在廣東5個養殖場分離到317株氣單胞菌(均分離自未發病魚及其養殖環境)，其對氟喹諾酮類藥物較敏感，對環丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星的耐藥率分別為14%、11%和3%。

目前我國水產養殖中細菌對不同喹諾酮類藥物的耐藥率各有差異，第一代和第二代的喹諾酮類藥物的耐藥性較高(對萘啶酸的耐藥率超過60%)，而對氟喹諾酮類藥物仍較敏感，但是近幾年來氟喹諾酮類耐藥性已呈現增長趨勢，喹諾酮類藥物的耐藥風險仍不容小覷[34]。在缺乏對喹諾酮類藥物使用的有效管理措施下，若出現大量不合理使用喹諾酮類藥物的狀況，那勢必會出現水產動物致病菌對喹諾酮類藥物產生更加嚴重的耐藥性，給水產動物的細菌性病害防治帶來難題，同時也會嚴重影響水產品的質量安全。

3 水產動物源細菌質粒介導的喹諾酮類耐藥基因研究概況

自1998年質粒介導的喹諾酮類耐藥基因發現以來，國內外對此耐藥基因的研究逐漸增多。各項研究顯示，質粒介導的喹諾酮類耐藥基因在世界各地均有發現，其分布廣泛且種類豐富，已報道的包括qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qnrVC、qepA、aac(6′)-Ib-cr和oqxAB 9種基因，還有一系列基因亞型[12]。關于水產養殖源質粒介導的喹諾酮類耐藥的研究正處于起步階段，目前在水產動物和水(海)產品上檢出的質粒介導的喹諾酮類耐藥基因型主要包括qnrA、qnrB(qnrB1、qnrB17、qnrB20)、qnrD1、qnrS(qnrS1、qnrS2、qnrS5)、qnrVC(qnrVC4、qnrVC6、qnrVC7)、aac(6′)-Ib-cr及oqxAB(表1)。其中，qnrS2和aac(6′)-Ib-cr在氣單胞菌和大腸桿菌中檢出頻率最高，在各類水產動物中流行廣泛[28,39,33,35-53]。qnrVC是弧菌特有的質粒介導的喹諾酮類耐藥基因型，主要在弧菌中流行[14-16]。據已報道文獻，質粒介導的喹諾酮類耐藥基因主要在一些特色經濟魚類如羅非魚、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、鰻鱺(Anguillajaponica)等，觀賞魚如錦鯉(Cyprinuscarpiokoi)、熱帶魚及龜鱉動物分離的細菌中檢出。在上述文章中也提到[28-29]，這些水產動物源的分離菌株對喹諾酮類藥物的耐藥率相對于其他品種高，可能與這些水產動物的養殖模式、養殖周期、用藥習慣等密切相關。

在喹諾酮類藥物的選擇壓力下，質粒介導的喹諾酮類耐藥基因可通過質粒、整合子等耐藥元件在不同種細菌間交換傳遞，對細菌耐藥性的產生和擴散起著重要的作用。隨著測序技術的提高和廣泛應用，不少學者開始從質粒介導的喹諾酮類耐藥陽性質粒的序列特征上揭示這些耐藥基因產生及傳播的機制。2011年，印度學者Majumdar等[35]首次對自魚源嗜水氣單胞菌分離的攜帶qnrS2的耐藥質粒pBRST7.6進行全序列測序，該質粒大小7621 bp，IncQ型，含有6個開放閱讀框(ORF)、5個編碼序列(CDS)，qnrS2位于編碼orf6的開放閱讀框中。西班牙學者Marti等[36]對自水環境分離菌株中提取的一個多重耐藥質粒pP2G1進行全序列分析，發現其質粒同時攜帶兩個質粒介導的喹諾酮類耐藥基因qnrS2和aac(6′)-Ib-cr，并且aac(6′)-Ib-cr還位于Ⅰ類整合子的基因盒陣列中。另外，馮永永等[33]也發現，aac(6′)-Ib-cr可單獨或與利福平耐藥基因arr3位于同一個Ⅰ類整合子基因盒陣列中。已有報道顯示，qnrS2多位于IncQ和IncU等可接合質粒上[35,43,46,52]，也可位于非接合性ColE型質粒上[47]。有報道表明[15,31,44,48,50-51]，質粒介導的喹諾酮類耐藥基因與其他類藥物的耐藥基因如四環素類耐藥基因、β內酰胺類耐藥基因、氨基糖苷類耐藥基因、磺胺類耐藥基因等共同存在同一質粒或整合子基因盒中，從而增強細菌多重耐藥的發生，這大大提高了臨床對患病水產動物治療難度，而且給水產品的質量安全帶來風險，不僅是水產養殖面臨的挑戰，也是關系到我們每個人生命健康的重要問題。

4 小結與展望

從發現至今，喹諾酮類藥物已廣泛應用于水產動物細菌病的治療[6,54-55]，隨之而來的是水產動物病原菌對喹諾酮類藥物產生的耐藥性問題；而食源性細菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，雖然不是水產動物的病原菌，但也可在水產品中分離到，可能與養殖、加工、流通等環節有關，食源性細菌的耐藥性問題在近年來已經逐漸受到人們的重視。由于耐藥菌和耐藥基因可在不同細菌不同環境介質中交換傳遞，也可通過食物鏈傳遞給人類，因此水產動物中存在的耐藥菌和耐藥基因風險均對食品安全和人類身體健康產生潛在危害[56]。

由于水產養殖動物的種類繁多、個體差異較大和特殊的生長環境等原因致使科研工作者對于喹諾酮類藥物藥效動力學及藥代動力學的研究很難覆蓋到所有的水產養殖動物，這就導致當相應的病害發生時，對喹諾酮類藥物的使用缺乏全面的科學用藥指導。世界范圍內每年都會有大量的喹諾酮類藥物用于水產養殖業，當喹諾酮藥物在水產動物體內代謝不完全時，在環境壓力的選擇下會促進細菌耐藥性的產生。這便要求科研工作者更加嚴格地掌握各種疾病的適應癥，對比該藥物的藥效動力學及藥代動力學參數，提供最適合的藥物使用量與使用的間隔時間，以保證有效治療疾病的同時減少喹諾酮類藥物的排出和在動物體內的殘留，從而減少細菌對喹諾酮類藥物產生抗藥性的可能。總之，科學合理地使用抗菌藥物是減少喹諾酮類藥物耐藥性產生的重要措施之一。

質粒介導的喹諾酮類耐藥是細菌對喹諾酮藥物產生耐藥性的重要途徑之一，由于質粒擁有特殊的水平轉移機制使其耐藥性的傳播更為便捷，而且一般攜帶質粒介導的喹諾酮類耐藥基因的菌株初期僅對喹諾酮類藥物表現為低水平耐藥，因此此類耐藥很難通過表型檢測；但通過逐步累積或者偶聯協同其他耐藥機制則會產生高水平的耐藥。因此，有必要建立完善的質粒介導的喹諾酮耐藥機制的檢測方法，采用PCR等分子生物學手段對養殖場以及養殖場附近環境進行監測。另外，應開展質粒介導的喹諾酮類耐藥發生及傳播機制的研究，給出相應避免耐藥的方法，如研發新型藥物來破壞和消除喹諾酮耐藥類相關的基因或蛋白等，避免喹諾酮類耐藥的傳播。

總之，要在自身的思想觀念上重視水產養殖細菌喹諾酮類耐藥現象，科學、合理地使用喹諾酮類藥物，同時大力開展喹諾酮類耐藥機制的研究，減少喹諾酮類耐藥性的傳播，也要加強新型抗菌藥物的研發，從多方面減少喹諾酮類耐藥性的產生，以降低其對人類健康及自然環境的潛在危害。