仿刺參體腔液中皮質醇檢測方法研究

劉桂英，田 金，肖 瑤，吳金浩，宋 倫，高 穎，王志松

( 遼寧省海洋水產科學研究院，遼寧 大連 116023 )

皮質醇含量是反映腎上腺皮質功能的重要指標之一，海洋動物血清中的皮質醇激素含量隨應激強度呈現規律性變化，是可以用來衡量應激水平的重要生理指標[1]。皮質醇分泌過多或者不足，均會導致機體免疫功能下降，增加動物發生病害的幾率[2]。機體分泌皮質醇受外部環境影響，如擁擠和劇烈振蕩脅迫造成草魚(Ctenopharyngodonidellus)血液內皮質醇含量大幅度升高[3-4]；船舶噪聲影響有機體中的皮質醇水平，破壞有機體的繁殖發育和生長[5]；環境壓力促使魚類生成皮質醇激素，影響機體的新陳代謝等功能[6]。關于皮質醇的研究主要集中在海洋脊椎動物[7-13]，而海洋棘皮動物皮質醇的相關研究報道較少。仿刺參的體腔液類似于血液，研究仿刺參體腔液中皮質醇的含量來評價仿刺參(Apostichopusjaponicus)的應激水平，對于了解仿刺參的應激能力和免疫水平等生理功能具有重要意義。

目前測定血清皮質醇有化學發光法、放射免疫法、蛋白競爭法和高分辨質譜法等[14-18]，常用的是化學發光法，它具有檢測迅速、操作簡單等優點，但受血清蛋白結合的影響，不能反映實際發揮功能的皮質醇的情況；若基質不同，結合蛋白不同，會導致皮質醇的測定結果不準確[19-20]。因此，研究仿刺參體腔液中皮質醇的測定方法，對進一步探索皮質醇對仿刺參生理行為的影響，具有科學指導意義。

筆者基于超高效液質聯用的檢測方法，結合固相萃取的前處理技術，建立仿刺參體腔液中皮質醇的檢測方法。通過優化前處理技術，采用梯度洗脫的分離方式，以建立快速、靈敏、穩定的仿刺參體腔液皮質醇檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗仿刺參

仿刺參取自遼寧省海洋水產科學研究院實驗基地，分別為3齡仿刺參和幼參若干，自基地運回后，于循環水養殖系統中暫養10 d，暫養期間水溫保持在(25.0±0.5) ℃，鹽度約30，光照周期為14L∶10D。每日16:00過量投喂幼參1次，3齡參此溫度下進入夏眠不攝食。飼料為遼寧省海洋水產科學研究院自研飼料，主要由魚粉、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)粉、馬尾藻(Sargassumsp.)粉、海帶(Saccharinajaponica)粉和酒糟等組成。每日清污換水1次，24 h連續充氣。

1.2 儀器與試劑

Xevo TQD型超高效液相色譜質譜儀(美國 Waters公司)、氮吹濃縮儀(天津市恒奧科技發展有限公司)、Milli-Q超純水儀(美國 Milliopore公司)、離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、固相萃取柱(美國安捷倫公司，300 mg，3 mL)。

1.3 標準溶液配制

準確稱取適量(精確至1.0 mg)皮質醇標準品，用乙腈溶解，配制質量濃度為1 mg/L的標準儲備液，4 ℃保存，臨用時稀釋成所需用量。

1.4 樣品前處理

取樣時，將仿刺參置于冰盤中，自腹面剖開約1 cm，用1 mL無菌注射器吸取體腔液, 3齡參每頭吸取5 mL體腔液組成一個樣品; 因幼參體腔液含量少， 為保證樣品充足，每頭吸取1 mL， 5頭幼參的體腔液共5 mL合為一個樣品。將抽取的體腔液置于50 mL聚丙烯塑料離心管中，加入10 mL甲酸乙腈混合溶液(在10 mL乙腈中加入20 μL的甲酸)，充分搖勻，渦旋，加入1 g的氯化鈉和4 g無水硫酸鈉，充分渦旋混勻1 min，超聲10 min，靜置，以5000 r/min，4 ℃離心15 min，取乙腈相上清液4 mL，放入空的聚丙烯塑料離心管中，加入1 mL水，混勻，將待測溶液全部轉入，過固相萃取柱，重力自流，抽干小柱，收集全部流出液，45 ℃水浴濃縮，氮吹儀氮吹至液面高度恒定，用去離子水定容至1 mL，上清液經水相濾膜0.22 μm過濾至進樣瓶中，供超高效液相色譜—串聯質譜分析。

1.5 色譜條件

色譜柱：BEH C-18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱溫：30 ℃；流動相：A為體積分數為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈；流速：0.2 mL/min。梯度洗脫程序見表1，進樣體積10 μL。

表1 二元梯度洗脫順序

1.6 質譜條件

電噴霧電離(ESI+)源，正離子掃描；多反應監測(MRM)模式；離子源溫度：650 ℃；毛細管電壓：3.20 kV；錐孔電壓：45 V；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：650 L/h，錐孔氣流量：50 L/h。

2 結果與分析

2.1 線性關系、檢出限和定量限

采用樣品基質提取液配制質量濃度為0、5、10、20、50、100 μg/L的系列標準溶液，以質量濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線，得到目標化合物的線性回歸方程y=197.8x-1192和相關系數r=0.9920，結果表明，皮質醇在質量濃度0～100 μg/L內呈良好的線性關系，以3倍和10倍信噪比確定該化合物的儀器檢出限和定量限，分別為0.11 μg/L和0.35 μg/L。

2.2 回收率和精密度

取空白樣品，分別添加20、40、100 μg/L質量濃度水平的皮質醇，每個質量濃度水平測定5份平行樣品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分別為77%、96%和105%，精密度分別達到5.6%、3.2%和2.8%，試驗結果表明，本方法有較高的準確度和精密度，適合實際樣品的測定。

2.3 實際樣品測定

用本試驗所建立的方法，對幼參和3齡參體腔液進行檢測，幼參體腔液中未檢出皮質醇，3齡參混合體腔液中皮質醇的含量為6.91 μg/L，雌3齡參體腔液中皮質醇含量為6.28 μg/L，雄3齡參體腔液中皮質醇含量為6.21 μg/L，實際樣品與標準品溶液多重反應監測色譜圖見圖1。本試驗的樣品檢測結果與周曉夢等[21]結果不同，周曉夢等[21]是用平均體質量(31.68±3.29) g的仿刺參，而本試驗用的是平均體質量(15±2.59) g的仿刺參，分析可能是由于個體差異所致。

圖1 實際樣品與標準品溶液多重反應監測色譜

3 討 論

3.1 色譜條件的優化

因皮質醇為極性化合物，常用的色譜柱為C-18柱，本試驗采用BEH C-18柱和BEH HILIC柱在同一條件下進行分離，通過比較發現，BEH C-18柱的分離效果好于BEH HILIC柱，目標化合物的峰型尖銳，且相同質量濃度信號響應值高。乙腈和水、甲醇和水是液質分析常用的流動相，用這兩種流動相組成進行分析可知，乙腈和水的效果優于甲醇和水，在水中加入了0.1%的甲酸后，增強了目標物的離子化效率，減小了基質效應，在相同濃度峰響應值增高(圖1)。

流速和柱溫對保留時間和峰型均有影響。流速增加、柱溫升高均會使皮質醇的保留時間減小，峰寬變窄，峰型對稱尖銳，但若流速太大，柱溫太高，對色譜柱有損傷，減少色譜柱的壽命。選取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min的流速進行試驗，結果表明，在流速0.2 mL/min和柱溫30 ℃時效果最佳。

3.2 質譜條件的優化

在ESI+模式下對0.5 mg/L的皮質醇標準溶液進行質譜掃描分析，得到該化合物的分子離子峰[M+H]+，以分子離子為母離子，對其進行二級質譜掃描，質譜參數見表2。

表2 皮質醇的質譜參數

3.3 提取試劑的優化

有機提取常用試劑有乙腈、甲醇、氯仿等，根據文獻[18]，先用氯仿提取皮質醇，結果發現，氯仿的提取率較低，改用100%甲醇、80%甲醇、100%乙腈及80%乙腈對加標樣品進行提取，通過回收率比較提取效率，結果見圖2。由圖2可知，80%乙腈的提取效率高，為90%，由于添加甲酸能促進皮質醇提取，故在80%乙腈中，加入不同含量的甲酸進行提取，結果發現，80%乙腈中加入0.2%甲酸提取效率高，達到95%。為除去仿刺參體腔液的水分，加入無水硫酸鈉和氯化鈉，促使待測物由水相轉移到有機相。經過多次優化試驗，得到最佳的提取條件為10 mL 80%乙腈+0.2%甲酸、4 g無水硫酸鈉、1 g氯化鈉。

圖2 不同提取溶劑對皮質醇提取效率

3.4 凈化條件的優化

由于樣品基質中蛋白質和脂類含量較為豐富，干擾組分多，對凈化方法要求較高，液—液凈化法及基質固相分散法難以達到凈化要求，其提取液仍需進一步凈化方可用于儀器檢測。因此本研究通過試驗考察對比了Oasis HLB固相萃取柱、OasisPrime固相萃取柱、Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱的純化效果(圖3)，結果發現，Oasis HLB固相萃取柱雖有一定的凈化效率，但比較費時，需要經過活化、平衡和淋洗3個步驟。OasisPrime固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱提取效率較低。只有Captiva EMR-Lipid固相萃取柱提取效率高，操作時間短，只需將提取溶液直接過柱，保持一定的速度，就能快速去除脂肪、磷脂等雜質，減小基質效應，節省時間和溶劑。因此，選擇使用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作為凈化小柱。

圖3 不同類型固相萃取柱提取皮質醇的回收率

3.5 基質效應的評價

基質效應主要是由于樣品在離子化時基質成分與目標化合物相互競爭電離所致，包括基質增強效應和基質抑制效應。在液相色譜—串聯質譜定性定量分析中，基質效應會對儀器的靈敏度和重復性產生影響，進而影響檢測結果的準確性。體腔液的組織成分復雜，含有蛋白質、磷脂、氨基酸等大分子化合物，可能會抑制或增強基質效應。本試驗采用(基質匹配標準曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)的計算方法對皮質醇的基質效應進行評價[22]。當結果為正值時表示基質增強效應，結果為負值時表示基質抑制效應，絕對值越大則基質效應越強。通常認為，基質效應在±20%內為不顯著[23]。根據計算得知，仿刺參體腔液中皮質醇的基質效應為-15.3%，說明皮質醇存在基質效應，但影響不顯著，因此，為保證檢測結果的準確性，選擇相應空白基質溶液配制標準溶液繪制校正曲線來進行定量分析。

4 結 論

本研究結合固相萃取前處理技術，建立了仿刺參體腔液中皮質醇超高效液相色譜—串聯質譜檢測方法，該方法操作簡便，快速準確，靈敏度和精密度較高，符合仿刺參體腔液皮質醇低含量檢測的要求，為進一步研究仿刺參的應激能力和減少仿刺參病害提供技術支持。