血漿miR-92a和miR-93在急性ST段抬高型心肌梗死診斷及近期預后評估中的臨床價值分析

修明文, 邊毓堯

(河北中石油中心醫院急診科, 河北 廊坊 065000)

急性心肌梗死是威脅生命的冠狀動脈疾病發作，是尚未解決的具有高發病率和死亡率的臨床問題。血液供應不足和氧化應激導致心臟組織壞死，病理重塑和左心功能不全[1,2]。急性心肌梗死可分為兩類：ST段抬高型心肌梗死(STEMI)和非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)。在STEMI中，梗死相關的動脈通常被富含纖維蛋白的血塊完全阻塞，而立即再灌注治療是最初的方法。早期準確診斷STEMI對于獲得最佳治療效果至關重要[3,4]。因此，迫切需要能夠補充和改善當前STEMI診斷策略的新方法。近期研究發現，在STEMI期間血液和血漿中的幾種miRNA，例如miR-1、miR-133a、miR-208b、miR-499和miR-328的水平發生了變化，這表明循環miRNA的診斷在早期的STEMI中具有診斷價值[5]。本研究擬探討血漿miR-92a和miR-93在急性ST段抬高型心肌梗死診斷及近期預后評估中的臨床價值分析，為急性ST段抬高型心肌梗死的診斷及治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料:收集2016年8月至2018年9月在我院急診科確診的急性ST段抬高型心肌梗死患者160例為病例組。所有病例符合中華醫學會心血管病學分會2007年制定的不穩定型心絞痛和非ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南診斷標準，其中男80例，女80例，年齡為42～74歲，平均年齡(59.1±13.6)歲。另外招募了152名健康的成年人志愿者(心電圖正常，無心血管疾病史)作為對照組，對照組年齡和性別情況。性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料無統計學差異(P<0.05)，見表1。該研究得到本院研究倫理委員會的批準，并在每個患者的知情同意下收集樣品。納入標準：急性缺血性胸痛；心電圖異常(病理性Q波，ST段抬高或壓抑)；心肌壞死標志物(肌鈣蛋白(cTns)和肌酸激酶(CK))的水平超過正常范圍上限的兩倍。這些患者出現癥狀后不超過24h入院。排除標準：先前有MI或經皮冠狀動脈介入治療(PCI)，任何血液系統疾病，急性或慢性感染，嚴重肝功能不全，腎衰竭(腎小球濾過率(GFR)<15mL/min/1.73m2或經透析)的患者，或已知或排除治療的惡性腫瘤。終止、退出標準：患者依從性差；出現嚴重不良事件及其他原因致使繼續試驗困難。

1.2方 法

1.2.1各指標的測定:病例組及對照組患者清晨空腹及肱靜脈抽血；取靜脈血10mL置于EDTA抗凝管中，3000rpm離心，l0min，分離血漿(分別于入院后發病4h、發病8h、發病12h、發病24h、發病48h、發病72h、發病1周)；同時取靜脈血10mL置于無菌管中，室溫靜置30min，3000rpm離心，l0min，分離血清。貝克曼AU-480全自動生化分析儀(美國庫爾特公司)分析儀測定TG、HDL-C、LDL-C(TG、HDL-C、LDL-C試劑盒為貝克曼原廠自帶試劑)，德鐵HBS-1096B酶標儀(南京德鐵實驗設備有限公司)測定hs-CRP、NT-pro BNP(hs-CRP、NT-pro BNP ELISA試劑盒購于上海恒遠生物科技有限公司)。使用TRIzol試劑(卡爾斯巴德生命技術公司，美國，56488)從血漿分離總RNA。PrimeScriptTM RT預混液(中國大連寶生物，48789)用于合成第一鏈cDNA。然后使用Power SYBR Green PCR Master Mix(Carlsbad，CA，65486)和GAPDH作為內部對照，通過使用7900HT快速實時PCR系統(美國Applied Biosystems)進行定量聚合酶鏈反應(qPCR)。miR-92a、miR-93、GAPDH引物序列由上海生工科技合成。miR-92a正向：5'-GTCTGTAGCGTCAGTAAATGCCTGGATAGCCCTGTGATGCA-3'和miR-92a反向：5'-CTGTCTGTAGCTAGCGTAGAATGACGGTGAGCCTTGGAGTG-3'。miR-93正向：3'-CGTGCGTGCGATGCCAACAGTTGGTCGAGTTTTG-3'，miR-93反向：3'-CGGTGACCCCATGTGACAGTAAGCTGCGTCCT-3'GAPDH正向：5，-CTGTGCAGTCAGTCAGTCCTGTGACGTGA-3，和GAPDH反向：5，-CTGTCGGTGCCCATGCAGTCAGTTGCTGTGAGTGC-3，(反向)。RT反應在以下條件下進行：42℃15min; 85℃，5s;然后保持在4℃。PCR反應在95℃下進行30s，然后在7900HT實時PCR系統中進行40個循環(95℃5s和60℃34s)。分析RT-PCR結果并表示為CT的相對miRNA表達(閾值循環)值，然后將其轉換為倍數變化。

1.2.2隨訪:對急性STEMI患者出院后進行為期3個月的隨訪，隨訪主要不良心血管事件(MACE)發生情況，主要包括：心絞痛發作、再次血運重建、新發心力衰竭、中心原性死亡等。

2 結 果

2.1兩組一般情況比較:病例組性別、年齡、BMI、吸煙、飲酒、高血壓、高脂血癥等一般資料與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2兩組miR-92a、miR-93指標比較：與對照組比較，病例組發病4h、發病8h、發病12h、發病24h、發病48h血漿miR-92a水平降低，miR-93水平升高(P<0.05)；病例組發病72h、發病1周血漿miR-92a、miR-93水平無明顯變化(P>0.05)。時間分布顯示，miR-92a于急性ST段抬高型心肌梗死發病4h開始降低，12h達到最低值，72h后趨于正常；miR-93于發病急性ST段抬高型心肌梗死發病4h開始升高，8h達到最高值，72h后亦趨于正常。見表2。

表2 兩組miR-92a miR-93指標比較

2.3兩組血脂指標比較：病例組HDL-C水平低于對照組，TG、LDL-C水平高于對照組(P<0.05)，見表3。

表3 兩組血脂指標比較

2.4兩組hs-CRP、NT-proBNP指標比較：病例組hs-CRP、NT-proBNP水平高于對照組(P<0.05)，見表4。

表4 兩組hs-CRP NT-proBNP指標比較

2.5miR-92a、miR-93與各指標相關性分析：miR-92a與HDL-C，miR-93與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP正相關，miR-92a與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP，miR-93與HDL-C負相關(P<0.05)，見表5。

表5 miR-92a miR-93與各指標相關性分析

2.6各指標診斷急性ST段抬高型心肌梗死的價值分析：診斷急性ST段抬高型心肌梗死時，miR-93的AUC、敏感性、特異性、準確性、cutoff分別為0.851、76.3%、79.6%、82.6%、2.35；miR-92a的AUC、敏感性、特異性、準確性、cutoff分別為0.846、75.9%、72.6%、81.1%、3.59。，見表6、圖1。

表6 各指標診斷急性ST段抬高型心肌梗死的價值分析

圖1 miR-93、miR-92a診斷急性ST段抬高型心肌梗死的ROC曲線

2.7miR-92a、miR-93表達水平與患者預后分析：160例急性STEMI患者確診3個月內共發生20例(12.5%)MACE，其中心絞痛發作7例、中心原性死亡5例、心力衰竭8例，無靶血管再次血運重建。以中位數為界限分組，miR-92a高表達組MACE發生率明顯高于miR-92a低表達組(P<0.05)，miR-93高表達組MACE發生率明顯低于miR-93低表達組(P<0.05)，見表7。

表7 不同miR-92a miR-93表達水平患者預后比較n(%)

2.8急性ST段抬高型心肌梗死患者MACE發生情況的多元Logistic回歸分析：以急性ST段抬高型心肌梗死患者是否發生MACE為應變量(是=1，否=0)，患者基本特征、血清學指標及miR-93、miR-92a等作為自變量進行多因素logistic逐步回歸分析，結果發現高水平miR-93及低水平miR-92a為急性ST段抬高型心肌梗死患者發生MACE的危險因素(OR=4.62、5.02，P<0.05)，見表8。

表8 急性ST段抬高型心肌梗死患者MACE發生情況的多元Logistic回歸分析

3 討 論

MicroRNA(miRNA)是長度為17-27個核苷酸的小型非編碼細胞RNA。通過與靶標mRNA的3'UTR配對，它們通過翻譯抑制和轉錄物切割充當基因表達的序列特異性調節子。最近的研究表明，miRNA是許多疾病發病機理中的重要調節劑。AMI中涉及許多循環miRNA。這些包括心臟特異性miRNA(miR-208a)和非心臟特異性miRNA(miR-126，miR-328，miR-134)[6]。

miR-92a可通過阻斷蛋白激酶B信號通路抑制心血管內皮細胞增殖和集落形成，在急性心肌炎、類風濕關節炎、骨關節炎中，miR-92a表達降低，提示miR-92a在此類疾病中發揮重要調控作用[7]。miR-92a在幾種肌肉疾病中均被下調，例如杜興氏肌營養不良癥和失神經引起的肌肉萎縮癥。miR-92a的過度表達可能導致肌肉肥大。據報道，與炎癥相關的miRNA miR-93與多種心血管疾病的發病機制有關。血漿樣品的微陣列篩選顯示與健康對照組相比，肺動脈高壓患者的miR-93水平降低。此外，這些患者的血漿miR-93水平是存活率的重要預測指標[8]。不穩定型心絞痛患者的血清中miR-93也失調。通過應用包括miR-132，miR-93和miR-186的miRNA面板，明顯提高了不穩定型心絞痛的診斷準確性[9]。此外，轉錄因子cMyb，NOTCH3受體和非轉移性黑色素瘤蛋白B是miR-93的潛在靶標。這兩個miRNA的調節異常可能與心臟損害以外的病理狀況有關[10]。

本研究顯示，病例組發病4h、發病8h、發病12h、發病24h、發病48h血漿miR-92a水平降低，miR-93水平升高；同時，時間分布顯示，miR-92a于STEMI發病4h開始降低；miR-93于STEMI發病4h開始升高；且miR-92a與HDL-C，miR-93與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP正相關關系明顯；miR-92a與TG、LDL-C、hs-CRP、NT-proBNP，miR-93與HDL-C負相關關系明顯；這提示，miR-92a、miR-93在STEMI早期即可發生變化，具有較高的敏感性；此外，ROC分析表明，這兩種miR-92a、miR-93可能是STEMI的診斷標志物。預后比較顯示，miR-92a高表達組MACE發生率高于miR-92a低表達組，miR-93高表達組MACE發生率低于miR-93低表達組；高水平miR-93及低水平miR-92a均為急性ST段抬高型心肌梗死患者發生MACE的危險因素；這說明，高水平的miR-93以及低水平的miR-92a均為急性ST段抬高型心肌梗死患者不良預后危險因素。

綜上所述，急性ST段抬高型心肌梗死患者血漿miR-92a降低，miR-93升高；miR-92a、miR-93可作為診斷急性ST段抬高型心肌梗死的早期敏感生物標志物；高水平的miR-93以及低水平的miR-92a均為急性ST段抬高型心肌梗死患者不良預后危險因素。