依托咪酯對PI3K/AKT通路及非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響

杜佳楠，戴勤學，容鳳嬌，徐 夏

(1海南省三亞市中心醫院/海南省第三人民醫院麻醉科，海南 三亞 572000 2.溫州醫科大學附屬第一醫院麻醉科，浙江 溫州 325000)

肺癌是世界上癌癥死亡的主要原因，也是我國的一個主要健康問題，約占所有癌癥相關死亡人數的28%[1]。肺癌的兩種主要形式是小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，其分別占所有病例的約15%和85%[2]。NSCLC通常會產生對放射和化療的抵抗力，其整體5年生存率僅為15%，因此尋求新的治療方法對于減少NSCLC的發病率是必要的。依托咪酯系一種催眠性靜脈全麻藥，是咪唑類衍生物，安全性大，是麻醉誘導常用的藥物之一。近期研究發現，依托咪酯具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集和預防癌癥的特性，其對肝癌、直腸癌和肺腺癌的發生及增殖活性具有抑制作用[3]。依托咪酯也具有抗炎和抗氧化作用。已證明丙泊酚可以抑制嗜中性粒細胞粘附于血管內皮細胞，清除氧自由基，減輕氧化損傷并減少炎性細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)的釋放。臨床上使用的丙泊酚濃度可促進細胞凋亡并抑制人類癌細胞的侵襲。在肺癌中，依托咪酯通過下調HOX轉錄反義RNA(HOTAIR)介導的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/p70核糖體蛋白S6激酶(p70S6K)途徑降低細胞活力并誘導細胞凋亡。此外依托咪酯可以抑制核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)，從而抑制肺癌細胞的增殖和侵襲[4]。PI3K/AKT途徑是涉及許多類型腫瘤發生的主要信號傳導途徑。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是85-kDa和110-kDa亞基的異二聚體并且具有酪氨酸激酶活性。PI3K介導從生長因子受體到蛋白激酶B(AKT)的激活信號，AKT是一種轉移到細胞核中的激酶，并磷酸化多種靶分子以介導信號[5]。PI3K/AKT途徑在調節癌細胞功能中起著至關重要的作用，包括血管生成，細胞侵襲和轉移，激活途徑誘導上皮-間質轉化(EMT)等。本研究擬探討依托咪酯對PI3K/AKT通路及非小細胞肺癌A549細胞凋亡的影響，為非小細胞肺癌的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要藥品、試劑與儀器:依托咪酯、5-氟尿嘧啶(純度99.99%，美國sigma公司，批號C7023、C5249)；Dulbecco改良的Eagle培養基(美國Life Technologies公司，批號MN12657)；細胞計數試劑盒-8(CCK-8)、BCA蛋白質測定試劑盒、RIPA裂解緩沖液、ECL化學發光試劑盒(碧云天生物技術研究所，批號CK04-500、CM04-611、P0519、P0816F)；膜聯蛋白V(Annexin V)異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒(美國賽默飛世爾科技公司，批號V13241)；Transwell室(美國Corning公司，批號BH41785)；TRIzol試劑(美國Invitrogen 公司，批號IK-0533)；SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(寶日醫生物技術北京有限公司，批號RR716、RM5037)；抗p-PI3K、p-AKT、抗β-肌動蛋白(英國Abcam公司，批號ab14798、ab20158、ab30557)；辣根過氧化物酶綴合的兔抗小鼠二抗(貴州賽蘭博科技有限公司，批號AQ43095)；680型全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Biosciences Accuri C6型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)；徠卡DM2700P正立金相顯微鏡(德國徠卡公司)；LightCycler-480熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司)。

1.2實驗細胞培養及分組:肺癌A549細胞購自中國醫學科學院腫瘤細胞庫。肺癌A549細胞在Dulbecco改良的Eagle培養基中生長，補充有10%熱滅活的胎牛血清，置于37℃，5%CO2的環境中。5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組的肺癌A549細胞培養方法同肺癌A549細胞組，各組分別加入5-氟尿嘧啶以及不同濃度的依托咪酯，使得5-氟尿嘧啶組最終濃度為100.0μg/mL(預試驗求出5-氟尿嘧啶對肺癌A549細胞的LC50為200.0μg/mL，以1/2LC50為作用劑量)，依托咪酯低、高劑量組最終濃度為100.0μg/mL、200.0μg/mL(預試驗求出依托咪酯對肺癌A549細胞的LC50為400.0μg/mL，以1/2LC50為高劑量，2倍間距求出低劑量)。以上各組每孔設6個平行樣，培養72h。

1.3細胞活力測定:通過細胞計數試劑盒-8(CCK-8)測定評估細胞增殖。各組細胞培養結束后，將細胞以3.0×103個/孔接種在96孔板中，用等體積的含有10μL CCK-8的新鮮培養基替換100μL用過的培養基在37℃孵育1h。使用酶標儀在450nm波長下測量每個孔的吸光度(OD值)。計算細胞存活率，細胞存活率=(實驗組OD-空白組OD)/(A549細胞組OD-空白組OD)。每個測定重復6次。

1.4細胞凋亡水平測定:使用膜聯蛋白V(Annexin V)異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒測定細胞的凋亡率。各組細胞培養結束后，收獲細胞并重懸于500μL結合緩沖液中。將細胞懸浮液與5μL膜聯蛋白V(Annexin V)異硫氰酸熒光素(FITC)和碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑在暗處溫育15min。向每個樣品中加入50μg/mL PI，之后使用流式細胞儀測定MCF-7細胞的凋亡。

1.5細胞侵襲遷移能力的測定:細胞培養結束后，收集細胞并以5×104個/mL的濃度重懸于無血清培養基中，然后將200μL細胞懸浮液加入上室中。在底室中填充500μL含有10%胎牛血清的培養基。溫育24h后，用棉簽除去未侵入的細胞，用結晶紫染色膜下表面的細胞并計數。

1.6細胞p-PI3K、p-AKT mRNA水平的測定:根據制造商的方案，使用TRIzol試劑從組織細胞中提取總RNA。使用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒從提取的RNA逆轉錄成cDNA。RT-qPCR反應的溫度循環曲線如下：95℃持續30s；40個循環的95℃持續5s；和60℃持續20s。為了驗證PCR產物的特異性，在擴增后立即進行熔解曲線分析，如下：加熱至95℃ 20s；冷卻至60℃，持續20s；加熱至95℃，轉換速率為0.11C/sec，同時連續采集熒光信號。所有反應均在LightCycler-480熒光定量PCR儀上進行，并一式三份。循環量化(Cq)值在三次重復中沒有差異超過0.5。將靶基因的水平標準化為內部對照基因的水平，以允許計算2-ΔΔCq值。Cq定義為熒光通過固定閾值的分數循環數。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，U6為內參基因。引物序列如下：p-PI3K正向，5'-GAAAGTGCTTCCTTTTTAGGG-3'和反向，5'-CAATGAGTCGTCCTTTCCTTGGAATC-3'；p-AKT正向，5'-CCGTGGTAGTCCTTCCTGAT-3'和反向，5'-TTGCATGCGTCCTTTCCTTCCTGAT-3'；U6正向，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和反向，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.7細胞p-PI3K、p-AKT蛋白水平的測定:用Hanks'平衡鹽溶液洗滌細胞兩次，并在RIPA裂解緩沖液中裂解，并在13000g，4℃下離心20min。隨后使用BCA蛋白質測定試劑盒根據制造商的說明書測定蛋白質濃度。將蛋白質樣品(20μg)用4×上樣緩沖液(TaKaRa)在95℃下變性5min。用補充有5%非磷酸鹽的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)封閉PVDF。將等量的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將凝膠轉移到PVDF膜上。然后將PVDF膜與下列抗體一起溫育：抗p-PI3K(1：500稀釋)、p-AKT(1：500稀釋)和抗-β-肌動蛋白(1：2000稀釋)，在4℃下過夜。用含有5%Tween的PBS洗滌PVDF膜三次，并與辣根過氧化物酶綴合的兔抗小鼠二抗在室溫下孵育2h。根據制造商的說明，使用ECL化學發光試劑盒來顯現蛋白質條帶。使用Image-ProPlus 6.0軟件以β-actin作為內參蛋白分析相對蛋白質表達水平。

2 結 果

2.1各組肺癌A549細胞OD值、存活率水平的比較:與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組OD值、存活率水平降低(P<0.05)，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組OD值、存活率逐漸降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯低劑量組OD值、存活率水平升高(P<0.05)，依托咪酯高劑量組OD值、存活率水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺癌A549細胞OD值存活率水平的比較

2.2各組肺癌A549細胞凋亡率水平的比較:與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組凋亡率水平升高(P<0.05)，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組凋亡率水平逐漸升高(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯低劑量組凋亡率水平降低(P<0.05)，依托咪酯高劑量組凋亡率水平升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌A549細胞凋亡率水平的比較

2.3各組肺癌A549細胞侵襲遷移能力的比較:與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組穿膜數降低(P<0.05)，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組穿膜數逐漸降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯低劑量組穿膜數升高(P<0.01)，依托咪酯高劑量組穿膜數降低(P<0.05)。見表3、圖1。

圖1 各組肺癌A549細胞穿膜數數目比較(結晶紫染色，200倍)

表3 各組肺癌A549細胞侵襲遷移能力的比較

2.4各組肺癌A549細胞p-PI3K、p-AKT mRNA的表達:與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA降低(P<0.05)，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA逐漸降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯低劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA升高(P<0.05)，依托咪酯高劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組肺癌A549細胞p-PI3K p-AKT mRNA表達水平的表達

2.5各組肺癌A549細胞p-PI3K、p-AKT蛋白的表達:與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組p-PI3K、p-AKT蛋白降低(P<0.05)，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組p-PI3K、p-AKT蛋白逐漸降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯低劑量組p-PI3K、p-AKT蛋白升高(P<0.05)，依托咪酯高劑量組p-PI3K、p-AKT蛋白降低(P<0.05)。見表5、圖2。

表5 各組肺癌A549細胞p-PI3K p-AKT蛋白表達水平的表達

圖2 各組肺癌A549細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平的比較

3 討 論

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，近十年來，我國肺癌的發病率翻了一倍。最常見的肺癌類型是非小細胞肺癌(NSCLC)，占病例的80-85%[6]。由于缺乏有效的治療或早期診斷，NSCLC患者術后生存率較低，腫瘤轉移和復發決定了患者的生存狀況。因此尋求新的治療手段對于NSCLC患者預后具有重要意義。依托咪酯已被證明在體內和體外具有癌癥預防活性[7]。動物和細胞培養模型研究表明依托咪酯抑制腫瘤形成、癌癥的發生和轉移。依托咪酯通過增強GADD153 mRNA的表達和轉錄活性，顯著抑制前列腺DU145和LNCaP癌細胞的增殖，導致細胞周期停滯和抑制增殖[8]。此外，依托咪酯能夠促進垂體瘤細胞凋亡[9]。有研究表明，依托咪酯參與調節關鍵信號通路，依托咪酯通過減少活性氧的生成來抑制LPS誘導的AKT活化和磷酸化，這對于巨噬細胞中LPS誘導的炎癥反應至關重要。同時，低劑量依托咪酯預處理可增加細胞外信號調節激酶1/2的激活，抑制AKT的激活[10]。依托咪酯激活抑制PI3K/AKT途徑，這被認為是癌癥進展的關鍵環節。本次研究結果顯示，與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組OD值、存活率水平、穿膜數降低，凋亡率水平升高，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組OD值、存活率、穿膜數逐漸降低，凋亡率水平逐漸升高；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯高劑量組OD值、存活率水平、穿膜數降低，凋亡率水平升高。這與上述討論符合，同時提示，依托咪酯能抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲，促進肺癌A549細胞凋亡。

PI3K/AKT途徑在調節生理和病理過程中起重要作用。在腫瘤發生和發展過程中，PI3K/AKT通路調節多種細胞行為，包括增殖，遷移和轉移等。此外，PI3K/AKT途徑被證明是調節癌細胞化療耐藥性的關鍵途徑[11]。AKT是PI3K/AKT途徑中的關鍵分子，其異常表達可直接影響PI3K/AKT途徑的功能。AKT是一種新的肌動蛋白結合蛋白，參與肌動蛋白細胞骨架的形成并增強PI3K磷酸化。AKT也被證實是一種致癌基因，在腫瘤的發生和發展中起著重要作用；在該過程中涉及大量信號傳導途徑，包括PI3K/AKT信號傳導途徑。AKT作用于PI3K結合并激活Gαi3，這是一種調節腫瘤細胞增殖和凋亡的經典信號通路[12]。體外細胞試驗發現，AKT在胰腺癌組織和細胞中以高水平表達，并與胰腺癌惡性程度相關。此外，微陣列分析揭示了AKT水平與病理分級之間的正相關關系；AKT的表達與腫瘤惡性程度密切相關，包括組織學分級和轉移，以及無進展生存期(PFS)和總生存期[13～15]。研究表明，AKT沉默通過PI3K/AKT信號通路抑制膠質瘤細胞的遷移和侵襲。本次研究結果顯示，與A549細胞組比較，5-氟尿嘧啶組、依托咪酯低、高劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA和蛋白降低，且隨著依托咪酯劑量的增加，依托咪酯各劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA和蛋白逐漸降低；與5-氟尿嘧啶組比較，依托咪酯高劑量組p-PI3K、p-AKT mRNA、蛋白降低。這提示依托咪酯通過減弱p-PI3K、p-AKT mRNA和蛋白磷酸化水平，進而抑制PI3K/AKT通路的激活傳導。

綜上所述，依托咪酯能抑制肺癌A549細胞增殖、侵襲，促進肺癌A549細胞凋亡；其機制與依托咪酯通過減弱p-PI3K、p-AKT mRNA和蛋白磷酸化水平，進而抑制PI3K/AKT通路的激活傳導有關。