復方紅根草片及其組方對多重耐藥菌的抗菌活性及逆轉耐藥性的研究

胡俊輝，王 瑩，趙靜怡，李建會，肖 旭，姜艷平，姚銀輝，宋 紅

(1.承德醫學院附屬醫院藥學部，河北 承德 067000 2.承德醫學院，河北 承德 067000)

隨著抗菌藥物長期廣泛、過度、不合理的應用，導致耐藥菌頻繁出現，并呈逐年上升趨勢，致使感染患者病情加重、死亡率提高，給臨床治療帶來極大困難[1]。近年來，越來越多的研究顯示，中藥及其復方制劑具有一定的抗菌作用，甚至體外研究顯示中藥及其復方制劑有逆轉細菌耐藥的作用[2,3]。CHINET細菌監測結果顯示，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)菌株分離率呈逐年上升趨勢，對美羅培南和亞胺培南的耐藥率上升幅度高達8倍，；鮑曼不動桿菌(Acinetobacter baumannii，AB)對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為69.3%和66.7%[1]。復方紅根草片是由金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草、野菊花5 味中藥組成的復方制劑，臨床常用于治療急性咽喉炎、扁桃體炎、腸炎等。本研究分析復方紅根草片及其組方5種中藥對耐藥肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌的抗菌活性及逆轉耐藥性，為抗菌治療提供研究依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗菌株:碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)源于2017年承德醫學院附屬醫院痰液分離菌株118株中的10株，耐藥鮑曼不動桿菌(Multi-drug resistant Acinetobacter baumanii, MDR-AB)源于2016年11月承德醫學院附屬醫院住院患者痰液分離菌株的中的10株，剔除同一患者同一來源的重復菌株。所有菌株均源于承德醫學院附屬醫院檢驗科，VITEK 2-Compact GN卡鑒定。

1.1.2儀器與試劑:VITEK 2-Compact GN-AST09藥敏卡(法國生物梅里埃公司產品)；水解酪蛋白瓊脂(MH)購自溫州康泰公司；藥敏紙片OXOID產品：哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南。

1.1.3實驗用藥:復方紅根草片(桂林三金藥業)，規格0.31g/片，每片相當于干膏0.12g；金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草、野菊花購自中國藥材。

1.2方 法

1.2.1藥液制備:將復方紅根草片溶于蒸餾水后進行濃縮，使用濃度達到1g/mL，過濾除菌密封后置4℃保存。將5種草藥分別取50g，分別加入5倍量蒸餾水100℃加熱3h，冷卻，過濾，濾渣再加250mL蒸餾水100℃加熱2h，分別合并藥液濃縮至50mL，相對濃度為1g/mL，過濾，取上清液，高壓滅菌，于4℃保存。

1.2.2菌液制備:將菌株接種于MH培養基中，于37℃培養24h，稀釋至濃度10×106CFU/mL，4℃冷藏備用。

1.2.3抑菌活性的測定:根據2017美國臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦，采用微量肉湯稀釋法分別測定復方紅根草片及其組方中5味草藥的抗菌藥的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。每組取10支試管編號，分別加入1mL肉湯，1號試管中加入1mL藥液，混勻后取1mL加入2號試管，混勻后取2號試管液體1mL加入3號試管，以此類推，至9號試管取1mL液體棄去，10號試管為對照組，不加藥液。于37℃培養24h，根據濁度變化，判讀MIC值。每組重復3次，取平均值。

1.3逆轉細菌耐藥性試驗:分別測定抗菌藥物單藥的MIC，方法同復方紅根草片，抗菌藥物為亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、慶大霉素、頭孢吡肟。后測定兩藥聯合用藥的MIC值，組合方式為復方紅根草片及其組方5味中藥分別與上述四種抗菌藥物聯用。方法同單藥MIC測定。聯合用藥的抗菌活性用聯合用藥指數∑FIC表示，該數值計算方法如下：∑FIC=FIC-A+FIC-B，其中FIC-A表示B藥存在時A藥的MIC值與A藥單藥的MIC值之比，FIC-B表示A藥存在時B藥的MIC值與B藥單藥的MIC值之比。結果判斷標準為：∑FIC≤0.5表示兩藥有協同作用，∑FIC>4時表示兩藥有拮抗作用，0.5<∑FIC≤4表示兩藥無相關作用。

2 結 果

2.1抑菌作用結果:對CRKP抑菌試驗中，復方紅根草片的MIC為256μg/mL，組方中野菊花無抑菌作用，金銀花、穿心蓮、紅根草、魚腥草的MIC分別為500μg/mL、125μg/mL、125μg/mL、62.56μg/mL。對MDR-AB試驗中，復方紅根草片、穿心蓮、紅根草均無抑菌作用，魚腥草、野菊花、金銀花的MIC分別為62.5μg/mL、1000μg/mL，1000μg/mL，見表1。

表1 復方紅根草片及其組方對CRKP和MDR-AB的MIC值

2.2逆轉細菌耐藥性試驗結果:上述實驗結果所示，復方紅根草片對MDR-AB沒有抑菌作用，因此逆轉細菌耐藥性試驗只研究了CRKP菌。單藥對CRKP的結果如表2所示，CRKP對亞胺培南耐藥。聯合用藥抗菌活性試驗如表3所示，紅根草與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、慶大霉素有協同作用，金銀花與頭孢哌酮有協同作用，穿心蓮與亞胺培南、慶大霉素有協同作用，紅根草與亞胺培南、頭孢哌酮、慶大霉素有協同作用，魚腥草與亞胺培南、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢吡肟有協同作用，野菊花對CRKP無明顯作用，其他聯合用藥組均無相互作用。

表2 抗菌藥物單藥和兩藥聯合對CRKP的MIC值

表3 聯合用藥的∑FIC值

3 討 論

鮑曼不動桿菌和肺炎克雷伯菌是醫院感染的重要致病菌，其檢出率與耐藥率呈逐年上升趨勢，針對兩種耐藥菌的臨床治療藥物的選擇性很小，如何選擇耐藥菌的有效治療已成為世界難題[4]。大量研究顯示中藥材及其復方制劑在具有良好的抗菌作用，甚至對多重耐藥菌已有較好的抗菌活性，甚至可以逆轉細菌耐藥性[5,6]。中藥通過直接抑制細菌和提高人體免疫力間接抗菌，目前研究較多集中在中藥材及其復方制劑的抗菌作用研究，包括活性成分、作用靶點等，本課題組在一項研究中使用網絡藥理學方法分析了紅根草化學成分的分子機制，其關鍵作用蛋白基因PLG、MASP1、MASP2等涉及的主要信號通路和金色葡萄球菌感染有關。

隨著本院碳青霉烯類抗菌藥物的使用，導致了細菌耐藥比例逐年上升，給臨床治療帶來困難。本試驗研究了復方紅根草片及其組方5味中藥材對我院提取的MDR-AB和CRKP的抗菌作用及耐藥性逆轉試驗，結果顯示，復方紅根草片及5味中藥材對MDR-AB抗菌作用不明顯；對CRKP抗菌作用，除野菊花外均有一定的抗菌活性；在對CRKP耐藥性逆轉試驗顯示，復方紅根草片及5味中藥與選用4種抗菌藥物有一定的協同作用。中藥及其復方制劑逆轉細菌耐藥性效果明確，但中藥逆轉耐藥性的機制比較復雜，主要有消除R質粒、抑制β內酰胺酶、影響外排轉運因子的表達、對抗菌藥物具有增敏效果[7]等。章如玲[8]等研究了肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因分布與耐藥性的關系，以KPC-2為主，主要克隆系為ST11、ST15、ST764。

本研究結果顯示復方紅根草片及其組方5味中藥材對CRKP具有耐藥性逆轉效果，給臨床用藥研究提供一些依據。目前，對于中藥材及其復方制劑的抗菌活性及耐藥性研究主要為體外試驗，而且主要針對單獨菌株，因此，具有一定局限性，如中藥材產地不同、亞種不同、試驗菌多來源多元化等。在實際臨床應用中，中藥材及其制劑作用于機體或靶器官的過程較為復雜，因此，抗菌及逆轉耐藥作用與各個化學成分的作用靶點關系還需要深入研究，為中藥材及其制劑的開發利用提供依據。