超高效液相色譜-串聯質譜法測定葡萄中16種植物生長調節劑的殘留量

占繡萍，陳建波，馬 琳，陳 秀，黃蘭淇，劉 彬

(1.上海市農業技術推廣服務中心，農業農村部農藥質量監督檢驗測試中心(上海)，上海 201103；2. 上海市青浦區蔬菜技術推廣站，上海 201200)

植物生長調節劑(plant growth regulator，PGRS)是人工合成的對植物的生長發育有調節作用的化學物質，具有和植物內源激素具有相似生理功效和相似化學結構的化學合成物。植物生長調節劑能夠有效的掌控植物的生長和加強其抗逆性，有效的解決了許多農業生產中常見的技術問題，展現出了高效的調控能力和廣闊的應用前景。植物生長調節劑也是屬于農藥的一種，雖然大部分毒性較低，但是長期食用含有PGRS的食品，會對人體健康造成潛在的健康危害[1-5]。我國在新版GB 2763-2019《食品中安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量中》[6]，已經制定了19種植物生長調節劑在某些農產品中的最大殘留限量標準，可見安全使用植物生長調節劑越來越多的得到了政府的重視和人們的關注。

目前，國內外關于植物生長調劑的檢測方法主要采用酶聯免疫法、毛細管電泳法、氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質譜聯用法[7-19]。其中液相色譜-質譜聯用以其高靈敏度和高選擇性，被更多的應用。樣品前處理方法中，分散固相萃取技術自2003年提出以來，在水果、蔬菜等農產品農藥多殘留檢測中得到廣泛應用。其優點是前處理簡單方便，不僅化學試劑用量少，還能有效去除色素、果糖、脂肪等物質的干擾，不易造成待測成分損失。本研究采用緩沖鹽/分散固相萃取和液相色譜-串聯質譜技術，兼具簡單、快速、高靈敏度、抗干擾能力強等優點，適合葡萄中植物生長調節劑多殘留的定性定量檢測。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置 Agilent1290 UPLC-Agilent6460超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀：配ESI源，T25DS25高速勻漿分散器；GB11240-89電熱恒溫水浴鍋；AC-40氮吹濃縮器；國華SHAC恒溫振蕩器；TDL-5-A離心機；Milli Q超純水系統；漩渦混合器(SCI LoGex MX-S)。

1.2 試劑乙腈和甲醇 (色譜純，德國Merck)，甲酸(色譜純，美國Fluka)，乙酸銨(色譜純，美國TEDIA)，高純水，氯化鈉(分析純)；十八烷基鍵和硅膠(C18)吸附劑：43～60μm，N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑：40～60μm，無水MgSO4， 凈化管(含100 mg PSA+300 mg MgSO4)。16種農藥標準品： 矮壯素、甲哌啶、抑芽丹、N6-腺嘌呤、赤霉酸、芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、脫落酸、噻苯隆、對氯吡氧乙酸、氯吡脲、蕓苔素內酯、多效唑、2，4-D、烯效唑、戊唑醇(純度均>96%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)。

稱取適量標準品，分別用甲醇配制成100mg/L的儲備液并儲存在-4℃冰箱中。根據實驗需要用甲醇稀釋標準儲備液，配成適當濃度的混合標準工作溶液。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 提取 準確稱取粉碎并混勻后的葡萄樣品10g (精確至0.01g)，置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入20mL5%乙酸的乙腈溶液，高速勻漿提取1min，加入4g硫酸鎂、1g檸檬酸鈉、0.5g檸檬酸氫二鈉、1顆玻璃均質子，渦旋1min，4 000r/min離心5min，靜置60min，待乙腈相和水相分層。

1.3.2 凈化 葡萄樣品凈化：取4mL上層乙腈相溶液置于QuEChERS離心管(含100mg PSA+300mg MgSO4)，渦旋混合1min，以4 000r/min 離心5min，移取上清液，過0．22μm有機濾膜后，待測。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱： Agielnt Poroshell 120 EC-C18柱( 3.0mm×100mm，2.7μm) ； 以0.1%甲酸+5mmoL乙酸銨水溶液( A 相) 和甲醇(B 相) 為流動相進行線性梯度洗脫； 梯度洗脫程序： 0～1.0min，A 相的比例保持90%，1.0～2.5min，A 相的比例由90%降到70%，2.5～4.5min，A 相的比例由50%降到5%，4.5～7.0min，A 相的比例由5%降到1%，7.0～8.0min，A 相的比例保持1%%； 流速為0.35mL/min； 進樣量： 2 μL； 柱溫： 40 ℃。

1.4.2 質譜條件 采用AJS ESI源，分段多反應監測模式(MRM)檢測(其中第1段：0～2.30min，正離子掃描，不加EMV電壓；第2段：2.3～4.8min，正離子掃描EMV加400v；第3段：4.8～5.4min，負離子離子掃描EMV加400v； 第4段：5.4～8.0min，正負離子同時掃描，負離子EMV加400v，正離子不加EMV)。霧化氣壓力：310.3kPa(40psi)；干燥氣溫度與流速：300℃，7L/min；鞘氣溫度與流速：350℃，12L/min；毛細管電壓：正離子3 000v，負離子3 500V。16種農藥的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(表1)。

表1 16種農藥的質譜分析參數

續表

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化 本試驗采取正負切換離子模式采集，選擇流動相時，不僅需要關注正離子電離化合物的相應，更重要的是負離子電離化合物在流動相影響下的峰形和相應靈敏度情況。試驗選擇了有機溶劑甲醇、乙腈作為強洗脫相；水、含0.1%甲酸溶液、含5mmol/L 甲酸銨、含5mmol/L乙酸銨溶液作為弱洗脫相，對其不同搭配進行了比較。

首先以甲醇-水、乙腈-水作為流動相來分析，結果發現在乙腈-水洗脫的時候，副模式下電離的化合物如赤霉酸、脫落酸、對氯吡氧乙酸及2，4-D靈敏度很低，幾乎不出峰；且正模式電離的化合物如芐基腺嘌呤、吲哚乙酸、氯吡脲、噻苯隆、N6-異戊烯基腺嘌呤等5種靈敏度偏低的化合物，響應也明顯偏低；其他靈敏度好的化合物，雖然用乙腈電離被增強，但是已經超出了檢測必需的必要度。所以本試驗選擇甲醇作為強洗脫相。對比甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液、甲醇-0.1%甲酸-5 mmoL/L甲酸銨溶液和乙腈-0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液為流動相時，發現甲醇- 0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液對于靈敏度偏低的化合物電離效果最好，響應高，對副模式采集的峰形和響應都較好。因此選擇甲醇和0.1%甲酸-5 mmoL/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.2 質譜條件優化 使用單針自動進樣分析目標化合物的標準溶液，優化16種農藥的質譜條件。化合物進入一級質譜后，可產生穩定的[M+H+離子或[M-H]-離子。其中對氯吡氧乙酸、2，4-D、脫落酸、赤霉酸，形成穩定的[M-H]-離子，其他農藥均選擇了[M+H]+離子。確定了化合物母離子后，在SIM 模式下，對化合物的Fragment(碎裂電壓)進行優化；母離子進入二級質譜，發生斷裂或重排等反應產生不同的離子碎片。在Product Ion模式下，對化合物母離子施加一定量的碰撞能量(CE)，得到其相應的離子碎片；最后在MRM 模式下，優化目標物離子碎片的最佳碰撞能量。對于正負離子同時采集時，發現負離子靈敏度偏低，根據化合物靈敏度高低不同，故EMV(電子倍增管電壓)負離子掃描時分別加-200、-400 V，而正離子采集的化合物中，僅抑芽丹靈敏度較低，所以分段采集并給它加+200V，從而提高檢測靈敏度。并同時優化了質譜毛細管電壓、碎裂電壓、碰撞能量、電子倍增管電壓等質譜條件。16種農藥和空白葡萄的MRM 色譜圖(圖1、圖2)。

2.3 前處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑優化 查詢文獻，大多數植調劑在酸性條件下提取，穩定性明顯高于中性條件的提取。因此本研究采取乙腈加不同濃度的乙酸作為提取劑，來比較回收率情況。以0.1%、1%、2%、5%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑，平行操作3次，考察4種提取溶劑在同一種凈化包(100mg C18、100mg PSA 、300mg MgSO4混合)處理效果(圖3) 。當提取溶劑為5%乙酸乙腈時，除了矮壯素、甲哌啶外，其他植調劑平均回收率70.4%～109.7%，而且明顯優于其他三種提取劑。這可能是由于酸性條件抑制了植物生長調節劑中羧基的電離，從而增加了其在乙腈中的溶解度。

2.3.2 凈化條件優化 QuEChERS方法作為一種新型的前處理方法，較普通的SPE方法具有明顯的優勢；用QuEChERS方法溶劑使用量相對較少，無需淋洗，操作簡單，所需時間少，所需凈化劑的材料價格相對低廉。如N-丙基乙二胺(PSA)、C18、石墨化炭黑(Carb)是常用的吸附劑材料。PSA吸附劑可有效去除樣品中的有機酸、脂肪酸和糖等干擾物；C18吸附劑對極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇類、色素等大分子基質干擾物有較好的吸附效果；Carb吸附劑對去除葉綠素類胡蘿卜素等色素以及固醇類雜質有很好的效果。

試驗選擇葡萄樣品進行研究，C18和PSA均能不同程度的去除花色苷，但是比較提取溶劑優化試驗中發現：去除雜質的同時，矮壯素、甲哌啶也可能同時被吸附了，所以不再考慮Carb，因此采用100 mg C18+100 mg PSA+300 mg MgSO4、100 mg C18+300 mg MgSO4、100 mg PSA+300 mg MgSO43種凈化劑一定比例的組合，所得的回收率結果(圖4)。結果發現，對于矮壯素、甲哌啶、抑芽丹等幾種極易被吸附的植調劑，發現用PSA凈化的回收率能滿足要求，優于其他組的搭配的凈化劑。在這種方法下，16種植調劑的平均回收率在71.5%～99.3%，滿足殘留檢測要求。

2.4 線性范圍和檢出限 在優化的條件下進行了方法學的考察。用甲醇配制16種植調劑的混合標準溶液，質量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/L，進樣2μL，以MRM定量離子的色譜峰面積(Y)對分析物質量濃度(X， mg/L)建立標準曲線，相關系數(R2)在0.986 6～0.999 7之間，表明各化合物在相應的濃度范圍內呈良好的線性關系。以3倍信噪比(S/N)確定檢出限(LOD)，得到16種農藥的LOD為0.03～1.0 μg/kg。列出了16種植調劑的保留時間、線性方程、相關系數及檢出限(表2)。按照保留時間先后分別列出16種植調劑各自的色譜圖和質譜圖(圖5)。

表2 16種植調劑的保留時間、線性方程、相關系數、檢出限

2.5 回收率、精密度和定量限 選用不含目標化合物的兩種葡萄空白樣品陽光玫瑰(綠皮葡萄)和巨玫瑰(紫皮葡萄)，通過添加回收試驗，考察了方法的回收率和精密度(n=5)。16種植調劑的添加濃度水平為0.05、0.10、0.50mg/kg，結果表明，16種植調劑的平均加標回收率范圍為71%～114.5%，RSD在0.9%～17.8%之間，方法的回收率和精密度均符合殘留分析要求。

表3 陽光玫瑰和巨玫瑰葡萄中16種植調劑的回收率、精密度和定量限

續表

3 小結

本文通過對提取溶劑、凈化劑和質譜條件的優化，建立了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定葡萄中16種植物生長調節劑殘留量的方法。該方法簡便快捷、靈敏可靠，線性、準確度和精密度較好，同時提高了實驗室的檢測速度，為葡萄中16種植調劑的多殘留檢測、風險評估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。