香檸檬精油對子代自閉癥大鼠焦慮行為與認知能力的影響研究

王舒婷，張 楠，姚 雷*

1上海交通大學 農(nóng)業(yè)與生物學院；2上海交通大學 設計學院，上海 200240

自閉癥(autism或autistic disorder)，是一類具有生物基礎、持續(xù)性的發(fā)育障礙類疾病，屬于自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder，ASD)中較嚴重的發(fā)病狀況[1]。我國有嚴重自閉癥患者約65萬，癥狀較輕者約有500多萬[2]。自閉癥患者常在社交溝通方面出現(xiàn)障礙，出現(xiàn)刻板行為，學習能力下降伴隨焦慮、癲癇[1]。據(jù)報道，約有三分之一的自閉癥患者都患有高5-羥色胺血癥[3]。近年來，自閉癥發(fā)病率不斷增高且覆蓋率高，正在引起世界各國的重視。藥物治療可在一定程度上控制自閉癥一些臨床癥狀，并且利用行為治療及一些輔助療法的配合實施可以起到一定的治療效果[4]，但具有一定的副作用[5]。苯丙異惡唑類衍生物利培酮于2006年被美國食品及藥品管理局批準用于自閉癥的治療，是第一個用于治療自閉癥的抗精神病藥物。其主要通過調控5-羥色胺與多巴胺系統(tǒng)發(fā)揮作用[6]，目前被較多的應用于兒童自閉癥的臨床治療中[7]。除精神類藥物外，目前也有不少補充與輔助療法應用于自閉癥的治療中[8]。

精油提取自芳香植物，具有分子量小、吸收快、接受度高的特點。已有大量研究證明精油可以通過嗅覺通路作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，快速達到緩解焦慮、抑郁情緒及改善認知障礙的作用[9]。香檸檬精油提取自蕓香科柑橘屬植物香檸檬(Citrusaurantiumbergamia)的果皮，化學成分以單萜烯、單萜醇、酯類為主，是一種在芳香療法中常被用于緩解焦慮情緒的精油[10]。

丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)模型是經(jīng)典的自閉癥動物模型。Gentile[11]報道了母體孕期暴露于VPA環(huán)境容易誘發(fā)胎兒產(chǎn)生自閉癥。Narita證實孕鼠暴露在VPA環(huán)境導致其子代鼠海馬區(qū)5-羥色胺濃度升高，認為給藥后的孕鼠可以作為有用的自閉癥生化模型[12]。目前已有不少研究通過在孕鼠懷孕第12.5天時單次腹腔注射VPA來建立自閉癥動物模型[13]。同時從體重、尾長、前庭運動、嗅覺、睜眼等發(fā)育學指標上評價了模型的可靠性，認為VPA誘導的子代自閉癥大鼠模型是復制率較穩(wěn)定的一種造模方式，具有良好的表現(xiàn)效度和結構效度。同時有學者采用該模型評價了一些天然產(chǎn)物對于緩解自閉癥癥狀的作用[9,10]。

本研究采用VPA誘導建立子代自閉癥大鼠模型，研究嗅聞香檸檬精油對子代自閉癥大鼠焦慮行為以及認知能力的影響，同時探討嗅聞香檸檬精油可能影響的神經(jīng)遞質通路，為香檸檬精油在緩解自閉癥癥狀的應用中提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年SD大鼠(SPF級)，♂體重300±20 g，♀體重260±20 g，經(jīng)上海交通大學實驗動物中心購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司。實驗動物均飼養(yǎng)于上海交通大學實驗動物中心飼養(yǎng)間，光照條件為晝夜循環(huán)光照(12 h/12 h)，環(huán)境溫度為25±1 ℃，相對濕度為50%±5%，大鼠自由攝食及飲水，環(huán)境安靜衛(wèi)生。實驗中所涉及的動物的使用和實驗方案均符合國際實驗動物評估和評審委員會的動物使用標準，實驗方案已經(jīng)通過上海交通大學實驗動物保護和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)的審核，IACUC許可編號為A2018084。

1.2 主要試劑

給藥試劑：VPA(美國Sigma公司，P1427113)，香檸檬精油(上海交通大學芳香植物研發(fā)中心提供)，山茶籽油(上海交通大學芳香植物研發(fā)中心提供)，利培酮(risperidone，RIS，西安楊森制藥有限公司)，生理鹽水(上海源葉生物科技有限公司)。

樣品處理液試劑：高氯酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2，分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，檸檬酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸氫二鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，L-半胱氨酸(分析純，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，1-庚烷磺酸鈉(色譜純，上海凌峰化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)。

單胺類神經(jīng)遞質標準品：多巴胺(dopamine，DA，美國Sigma-Aldrich公司)標準品，5-羥基色胺(5-hydroxy tryptamine，5-HT，美國Sigma-Aldrich公司)標準品，5-羥基吲哚乙酸(5-hydroxyindole-3-acetic acid，5-HIAA，美國Sigma-Aldrich公司)標準品，高香草酸(homovanillic acid，HVA，美國Sigma-Aldrich公司)。

1.3 主要儀器

擴香器(市售超聲擴香機)；自制不銹鋼熏香裝置(36 cm×24 cm×25 cm)：由下側熏香室(18 cm×24 cm×25 cm)與上側聞香室(18 cm×24 cm×25 cm)構成，兩室中間有一隔板，隔板中間有一圓形小孔，供擴香器揮發(fā)香氣至聞香室。

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS，美國安捷倫公司，7890B-5977A)；程控水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所，SMG-2)；曠場實驗裝置及分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司，XR-XZ301)；高架十字迷宮裝置及分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司，XR-XG201)；三箱社交裝置及分析軟件(上海欣軟信息科技有限公司，XR-XJ117)；高速冷凍離心機(德國Sigma公司,3K15)；超聲波細胞破碎儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司，XM-650T)；液相色譜-熒光檢測器(美國Waters公司，e2695/2475)。

1.4 香檸檬精油成分分析

采用氣相色譜-質譜聯(lián)用法分析香檸檬精油的化學成分。氣相色譜條件：DB-WAX(30 m × 250 μm,0.25 μm)色譜柱，進樣前10 μL樣品以500 μL乙醇和500 μL正己烷稀釋，載氣為高純氮氣(99.999%)，程序升溫(50 ℃維持3 min，隨后以4 ℃/min升至120 ℃，維持10 min，再以2 ℃/min升至220 ℃，維持2 min)，進樣口260 ℃，載氣流速1 mL/min，進樣量1.0 μL，分流比：10∶1。

質譜條件：離子源：230 ℃；四級桿：150 ℃；電離方式：EI+，70 eV；檢測器電壓：2 047 V；掃描方式：全掃描。

1.5 自閉癥大鼠模型及分組處理

動物模型制備參照Schneider[13]的造模方法。SD雌、雄鼠合籠過夜后，采用陰道涂片法發(fā)現(xiàn)精細胞記為妊娠第一天。把孕鼠分為兩組，對照組與VPA組(模型組)。VPA組在妊娠12.5天按600 mg/kg劑量單次腹腔注射VPA，同時給予對照組注射等量生理鹽水。對照組孕鼠所產(chǎn)子代鼠為正常對照組，VPA組所產(chǎn)子代鼠為模型組。從體重、尾長、睜眼指標，以及趨向、尋巢、游泳速度、學習記憶七個指標評價模型制備成功。

造模完成后，從模型組子代鼠隨機選擇52只進行實驗并分組：VB1組(香檸檬低濃度組)11只、VB2組(香檸檬中濃度組)9只、VB3組(香檸檬高濃度組)10只、VRIS組(利培酮組)6只、VC組(模型對照組)8只，另設NC組(正常對照組)8只。

1.6 給藥方式

香檸檬組：將100%香檸檬精油放入超聲擴香器中，擴香器按照18 mg/min的流速分別熏香30 s，熏香90 s，熏香180 s，平衡2 min，制得香檸檬低濃度組(0.42 μg/mL)、香檸檬中濃度組(1.25 μg/mL)、香檸檬高濃度組(2.5 μg/mL)的薰香環(huán)境。實驗中，將香檸檬精油裝入擴香器，將擴香器放入下側熏香室，根據(jù)不同濃度組別，分別熏香30、90、180 s，待其平衡2 min后，將實驗動物放入上側聞香室，自由探索10 min后將實驗動物取出。

模型對照組、正常對照組：將山茶籽油裝入擴香器，將擴香器放入下側熏香室，采用弱檔，熏香30 s，待其平衡2 min后，將實驗動物迅速放入上側聞香室，自由探索10 min后將實驗動物取出。

利培酮組：利培酮試劑按照1 mg/kg的濃度進行腹腔注射給藥。

以上各組均在出生后第33～39天每天相同時間段給藥，一天一次。

1.7 發(fā)育學及行為學觀察

1.7.1 發(fā)育學觀測

1.7.1.1 體重觀測

在子代鼠出生第7、14、21、28、35天分別檢測體重情況并記錄。

1.7.1.2 尾巴長度測量

在子代鼠出生后第7、14、21、28天分別測量尾巴長度并記錄。

1.7.1.3 趨向實驗

在子代鼠出生第7～11天進行趨向實驗。將幼鼠放置在25°表面光滑的傾斜板上，頭部向下，將幼鼠頭部由朝下轉為頭方向向上所需時間記為潛伏期時間，若實驗動物轉頭時間超過30 s，統(tǒng)一記為30 s。

1.7.1.4 尋巢實驗

在子代鼠出生第9～11天進行尋巢實驗。將幼鼠放置在一個290 mm×178 mm×160 mm的塑料容器，分別在兩端放置幼鼠所在窩別的墊料(至少使用3天)和干凈墊料，保證墊料所占區(qū)域據(jù)基本相當，觀察幼鼠頭和前爪進入墊料所在區(qū)域最前方所用的時間，將幼鼠從放入容器計時到找到所在窩墊料的時間用潛伏期表示。若實驗動物超過300 s，統(tǒng)一記為300 s。

1.7.1.5 睜眼觀測

在子代鼠出生第12～16天觀察計算各組睜眼得分情況：兩眼均未睜記為0；一睜一閉記為1；兩眼均睜記為2。

1.7.2 Morris水迷宮實驗

在子代鼠出生第28～32天進行第一次Morris水迷宮實驗，評價模型組與正常對照組認知能力的差異；在完成給藥干預、三箱社交實驗測試后，即子代鼠出生后第37～40天，進行第二次Morris水迷宮實驗，評價不同給藥干預對模型鼠認知行為的影響。

Morris水迷宮是直徑為150 cm，深度為32 cm的圓形水池，實驗前注入清水，水深約為20 cm，且水溫保持在22±1 ℃，在清水中加入墨水混合均勻。迷宮分為四個象限，在其中一個象限中放置直徑為10 cm的白色圓形平臺，迷宮上方安置與計算機相連的攝像機，同步記錄實驗動物的運動軌跡。水迷宮分為訓練階段—定位航行實驗和測試階段—空間探索階段。

1.7.2.1 訓練階段即定位航行實驗持續(xù)3～4天，每天實驗動物進行三輪實驗，每次實驗間隔15～20 min，每次隨機更換入水點，三個入水點分布在剩余三個象限中。每次訓練將實驗動物從入水點放入迷宮，在1 min的時間內(nèi)讓其尋找平臺并記錄其找到平臺的時間，如果在1 min內(nèi)實驗動物未能成功找到平臺則人為將其引導到平臺上并待10 s后取出。

1.7.2.2 訓練期結束后一天為測試階段，即空間探索實驗，將平臺去掉，并讓實驗動物在迷宮中摸索1 min，入水點位于平臺的相對象限且保證與之前平臺的距離為最長。

觀測指標：測試階段觀測實驗動物的穿越平臺次數(shù)、平均速度、原平臺象限運動路程/總路程、原平臺象限游泳時間/總時間、平臺周邊區(qū)域總路程以及平臺周邊區(qū)域總時間。

1.7.3 曠場實驗

子代鼠出生后第33天，在不同處理組熏香10 min后或腹腔注射利培酮30 min后進行曠場實驗。曠場裝置(100 cm×100 cm×100 cm)為上方開敞，五面圍合的箱體，箱子頂部安裝錄像監(jiān)控器來錄制動物的活動情況，將實驗動物放入箱體中央并開始計時，采用攝像頭記錄動物在5 min內(nèi)的自由活動，并記錄其在中央?yún)^(qū)域內(nèi)停留時間。

1.7.4 高架十字迷宮實驗

在子代鼠出生后第34天，在不同處理組熏香10 min后或腹腔注射利培酮30 min后進行高架十字迷宮實驗。高架十字迷宮裝置包括兩個50 cm×10 cm的相對開臂和兩個50 cm×10 cm×40 cm的相對閉臂。迷宮中央有一10 cm×10 cm的開闊部，迷宮距離地面50 cm。

將實驗動物放入迷宮中央并開始計時，觀察動物在5 min內(nèi)的自由活動，并記錄其進入開臂次數(shù)、進入閉臂次數(shù)、開臂停留時間與閉臂停留時間：

進入開臂的次數(shù)百分比=

進入開臂的停留時間百分比=

1.7.5 三箱社交實驗

在子代鼠出生后第35天，在不同處理組熏香10 min后或利培酮腹腔注射30 min后進行三箱社交實驗。三箱社交實驗裝置(120 cm×60 cm×40 cm)由三個矩形箱組成，每個箱子規(guī)格為60 cm×40 cm×40 cm，每個箱子之間的分隔板中間有通道使三箱相通，左側箱和右側箱的中央各放一個規(guī)格一致的束縛籠。實驗裝置上方安裝錄像監(jiān)控器，記錄動物在三箱中的活動情況。

將實驗動物放置在沒有放置束縛籠的中間箱體并開始計時，觀察動物在10 min內(nèi)的自由活動。在測試階段1，在左邊箱束縛籠中放入一陌生大鼠，右邊束縛籠空置，將兩扇活動門打開，讓實驗動物自由探索10 min。在測試階段2，在右邊箱束縛籠中放入一陌生大鼠，讓實驗動物繼續(xù)自由探索10 min。分別記錄實驗動物在兩個測試階段嗅探束縛籠1和束縛籠2的時間。

1.8 液相色譜-熒光檢測大鼠腦區(qū)多巴胺、5-羥色胺、5-羥基吲哚乙酸、高香草酸的含量

第二次水迷宮實驗結束后，剝離大鼠海馬和大腦皮層，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩悠方?jīng)組織裂解液(0.6 mol/L高氯酸，0.5 mmol/L EDTA-Na2，0.1 g/L L-半胱氨酸混合水溶液)處理后，經(jīng)超聲波細胞破碎機粉碎勻漿，冷凍離心取上清液，上清液加入沉降劑溶液(1.2 mol/L磷酸氫二鉀，2 mmol/L EDTA-Na2混合水溶液)處理后，冰浴靜置后經(jīng)冷凍離心，過濾得到樣品處理液。

液相色譜采用Syncronis C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm，美國Thermo)，以檸檬酸-乙酸鈉緩沖液為流動相溶液，流速為0.8 mL/min，進樣體積為10 μL，熒光檢測器的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280和330 nm。

精確稱取DA、5-HT、5-HIAA和HVA四種單胺類神經(jīng)遞質標準品，分別用標準品稀釋溶液(0.01 mol/L高氯酸，0.5 mmol/L EDTA-Na2，0.1 g/L L-半胱氨酸混合水溶液)溶解稀釋得到25 μg/mL的標準品儲備原液；檢測前將各標準品儲備原液進一步稀釋，混合，依次制得10、7.5、2.5、0.25、0.2、0.15、0.1 μg/mL的混合標準品溶液。以標準品進樣質量濃度X(μg/mL)對峰面積Y建立標準曲線，根據(jù)標準曲線計算大鼠海馬區(qū)與前額葉皮層中DA、5-HT、5-HIAA和HVA的含量。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 香檸檬精油的化學成分

GC-MS結果顯示香檸檬精油中相對面積大于0.5%的化學成分共有10種。包括萜烯、醇類以及酯類化合物，其中萜烯類占55.82%，酯類占29.82%，醇類占11.19%，主要成分為(+)-檸檬烯(37.76%)，乙酸芳樟酯(28.87%)，芳樟醇(11.19%)，γ-萜品烯(7.22%)以及(1S)-(-)-β-蒎烯(4.78%)。

表1 香檸檬精油GC-MS化學成分分析結果

2.2 造模后發(fā)育學與行為學觀測結果

2.2.1 發(fā)育學觀測結果

根據(jù)發(fā)育學觀測結果(圖1)，正常對照組實驗動物體重大于模型對照組實驗動物，與正常組相比，模型組大鼠在出生后第35天的體重顯著減少了5.86±2.19 g(P<0.05)。

圖1 兩組實驗動物發(fā)育學結果比較(n=75～84)

正常對照組實驗動物尾巴長于模型對照組實驗動物，與正常組相比，模型組大鼠在出生后第7、14、21、28天的尾巴長度分別顯著減少了0.53±0.11 cm(P<0.01)、0.88±0.11 cm(P<0.01)、1.33±0.11 cm(P<0.01)、1.62±0.11 cm(P<0.01)。

正常對照組實驗動物趨向實驗潛伏期短于模型對照組實驗動物，與正常組相比，出生后第7天的模型組大鼠潛伏期延長了3.67±1.22 s(P<0.05)，出生后第8、9、10天的模型組大鼠潛伏期分別顯著延長了4.28±1.22 s(P<0.01)、3.81±1.22 s(P<0.01)、4.81±1.22 s(P<0.01)；出生后第11天的模型組大鼠潛伏期延長了2.75±1.22 s(P<0.05)。

正常對照組實驗動物尋巢實驗潛伏期短于模型對照組實驗動物，模型組實驗動物嗅覺發(fā)育較正常組發(fā)育遲緩。與正常組相比，出生后第10天的模型組大鼠尋巢實驗潛伏期顯著延長了52.45±15.62 s(P<0.01)。

正常對照組實驗動物的睜眼分數(shù)高于模型對照組實驗動物，與正常組相比，出生后第13天的模型組大鼠睜眼得分顯著減少了0.24±0.08(P<0.05)。

2.2.2 行為學觀測結果

由表2可知，在第一次Morris水迷宮測試期，與正常對照組相比，模型組實驗動物每分鐘穿越平臺次數(shù)明顯減少了0.44±0.19次(P<0.05)，平均速度明顯下降7.01±1.54 cm/s(P<0.01)，平臺所在象限停留時間比率明顯減少4.76%±1.60%(P<0.01)，平臺所在象限運動路程比率明顯減少4.81%±1.45%(P<0.01)，平臺周邊區(qū)域總路程明顯減少275.09±58.44 cm(P<0.01)，平臺周邊區(qū)域總時間明顯減少4.44±1.75 s(P<0.05)。

表2 模型對照組與正常對照組實驗動物在Morris水迷宮中的行為學差異

2.3 曠場實驗結果

在曠場實驗中(圖2)，與模型對照組相比，利培酮組的運動總路程顯著提高了6.44±3.05 m(P<0.05)，香檸檬中濃度組實驗動物的運動總路程明顯提高了9.58±3.00 m(P<0.01)，香檸檬高濃度組的實驗動物運動總路程顯著提高了6.86±3.00 m(P<0.05)，香檸檬中濃度組實驗動物的中央?yún)^(qū)域停留時間明顯延長11.60±5.16 s(P<0.05)。利培酮組、香檸檬低、高濃度組實驗動物在中央?yún)^(qū)域停留時間與路程較模型對照組均有一定程度增加。

圖2 各處理對子代鼠在曠場模型中行為的影響(n=6～11)

2.4 高架十字迷宮實驗結果

在高架十字迷宮實驗中(圖3)，與模型對照組相比，香檸檬中濃度組的實驗動物進入開臂次數(shù)百分比顯著增加20.06%±8.04%(P<0.05)。香檸檬低、中濃度組的實驗動物進入開臂停留時間百分比與模型對照組相比均有一定程度增加。

圖3 各處理對子代鼠在高架十字迷宮模型中焦慮行為的影響(n=6～11)

2.5 三箱社交實驗結果

在三箱社交實驗中(圖4)，模型對照組與正常對照組相比，在測試階段一中與左邊陌生物體的接觸路程顯著下降20.34%±5.38%(P<0.01)。在測試階段二，利培酮組、香檸檬低、中濃度組實驗動物接觸右邊陌生物體的時間與路程百分比較模型對照組均呈現(xiàn)出增加趨勢。

圖4 各處理對子代鼠在三箱社交模型中社交行為的影響(n=6～11)

2.6 第二次Morris水迷宮實驗結果

在第二次水迷宮實驗中(圖5)，模型對照組與正常對照組相比，測試期的平均游泳速度顯著下降9.81±3.72 cm/s(P<0.05)。利培酮組、香檸檬低、中、高濃度組的實驗動物平均游泳速度較模型對照組均有一定程度增加。香檸檬低、中、高濃度組的實驗動物每分鐘穿越平臺次數(shù)、平臺周邊區(qū)域一時間與路程百分比與模型對照組相比均有一定程度增加，但沒有呈現(xiàn)出顯著性差異。

圖5 各組第二次Morris水迷宮實驗結果(n=6～11)

2.7 液相色譜-熒光檢測大鼠腦區(qū)多巴胺、5-羥色胺、5-羥基吲哚乙酸、高香草酸含量結果

通過表3檢測結果可知，模型對照組與正常對照組實驗動物相比，海馬區(qū)的5-HT含量顯著上升469.23±173.71 ng/g(P<0.05)。利培酮組、香檸檬中濃度組的DA含量較模型對照組分別顯著下降1 736.29±522.37 ng/g(P<0.05)、1 446.59±522.37ng/g(P<0.05)。香檸檬中濃度組的5-HT含量與模型對照組相比顯著下降424.63±181.43 ng/g(P<0.05)；利培酮組、香檸檬中濃度組的DA相對代謝率與模型組相比分別顯著提高12.94%±4.01%(P<0.05)、9.98%±4.01%(P<0.05)。利培酮組與香檸檬中濃度組的5-HIAA含量與5-HT相對代謝率與模型對照組相比均有一定程度下降，但與模型對照組相比沒有呈現(xiàn)出顯著性差異。

表3 各組海馬區(qū)四種單胺類神經(jīng)遞質樣品含量檢測結果

通過表4檢測結果可知，模型對照組與正常對照組實驗動物相比前額葉皮層的5-HT與HVA濃度分別顯著上升426.83±195.71 ng/g(P<0.05)、1 083.35±499.93 ng/g(P<0.05)。香檸檬中濃度組的DA濃度、HVA濃度與5-HT濃度與模型對照組相比分別顯著下降2 149.57±659.75 ng/g(P<0.05)、1 114.70±522.16 ng/g(P<0.05)、564.52±204.41 ng/g(P<0.05)。香檸檬中濃度組的5-HT相對代謝率與模型組相比顯著上升10.84%±4.04%(P<0.05)；利培酮組的DA濃度、HVA濃度與5-HT濃度較模型對照組均有一定程度下降；利培酮組、香檸檬中濃度組5-HIAA濃度較模型對照組均有一定程度下降，但與模型對照組相比沒有呈現(xiàn)出顯著性差異。

表4 各組前額葉皮層四種單胺類神經(jīng)遞質樣品含量檢測結果

3 討論

本研究采用Schneider[13]的造模方法，對妊娠12.5天的孕鼠采用單次腹腔注射VPA 600 mg/kg制備了自閉癥動物模型，此方法已被許多研究學者用于自閉癥病因及干預藥物效果評價的研究[9]。實驗結果表明正常對照組與模型組在體重、尾長、趨向、尋巢、睜眼、游泳能力、學習記憶能力七個發(fā)育學及行為學指標上均呈現(xiàn)出顯著性差異，這表明造模是成功的。

利培酮早期是治療精神分裂癥的藥物，能夠改善自閉癥患者的語言、感知覺、行為等[7]，在行為學水平上，利培酮處理并沒有有效減少模型動物的焦慮行為以及改善認知水平。這可能是因為利培酮并不是典型的抗焦慮藥物，在應用于臨床焦慮癥狀的緩解治療時，通常都是與很多其他主流抗焦慮藥物進行聯(lián)用[14]，另外也有文獻報道過利培酮對于改善自閉癥或癡呆模型中動物學習與記憶能力的作用不明顯[15]。已有研究表明利培酮通過作用于DA系統(tǒng)，特別是多巴胺D2受體來調控DA含量，使其恢復正常水平[6]。本研究中選取利培酮作為陽性對照藥。神經(jīng)遞質檢測結果表明利培酮組大鼠海馬區(qū)DA神經(jīng)遞質含量與代謝水平均發(fā)生了顯著性變化，但是對于5-羥色胺系統(tǒng)的影響并不顯著，這可能是造成利培酮無法有效改善模型動物焦慮行為與認知行為的原因。

香檸檬精油的揮發(fā)性活性物質主要為萜烯類、醇類、酯類，已有許多研究發(fā)現(xiàn)萜烯類、醇類、酯類物質具有抗焦慮、抑郁[16]以及改善認知障礙[9]的作用。本研究中，香檸檬中濃度組處理可以顯著提高大鼠在曠場中的運動總路程及中央?yún)^(qū)域停留時間，提高大鼠在高架十字迷宮中探索開臂次數(shù)百分比，這提示嗅吸該濃度香檸檬精油具有緩解子代自閉癥大鼠焦慮行為的作用。在三箱社交實驗和Morris水迷宮中，嗅吸香檸檬精油干預的模型鼠的社交與學習記憶能力有改善趨勢，但與模型對照組相比未呈現(xiàn)出顯著性差異。這提示在本研究中香檸檬精油改善模型鼠的社交與認知能力不是很明顯。在很多文獻中，精油在不同濃度都呈現(xiàn)出了功效差異，比如陳安琪的研究中低濃度與高濃度薰衣草精油緩解頭痛效果好[17]，佟棽棽的研究中中濃度的迷迭香抗抑郁效果最佳，低濃度效果好于高濃度[18]。這提示氣味分子在不同濃度造成的氣味編碼不同可能是導致功效差異的原因之一[19]。

DA、5-HT是與焦慮和認知行為相關的單胺類神經(jīng)遞質[20]，HVA和5-HIAA分別是DA和5-HT的代謝產(chǎn)物。多巴胺受體在腦內(nèi)廣泛表達，參與調控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能。自閉癥的發(fā)病癥狀與中樞神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺功能亢進有關[21]。5-羥色胺系統(tǒng)起源于中腦的背側縫際核群和正中縫際核群，投射到黑質紋狀體、邊緣系統(tǒng)和皮質，海馬也有5-羥色胺能神經(jīng)元的存在。抑制5-羥色胺能神經(jīng)元的活性，可以發(fā)揮抗焦慮功效。在本項研究中，模型對照組與正常對照組相比海馬與前額葉皮層區(qū)域的5-HT含量顯著上升，嗅吸香檸檬精油可以逆轉這一變化。同時顯著提高前額葉皮層中5-HT的代謝率以及海馬中DA的代謝率。這提示嗅聞香檸檬精油改善子代自閉癥模型鼠焦慮行為的作用機制可能與調控5-HT和DA系統(tǒng)有關。