葵花籽蛋白對慢性不可預知溫和應激小鼠的抗抑郁作用

盧肖蒙，齊 策，鄭 潔，孫 美，唐 雪，金 龍*，孫 進,*

1江南大學食品學院，無錫214122；2國家堅果加工技術研發專業中心，合肥 230601；3青島大學營養與健康研究院，青島 266071

抑郁癥具有情緒低落、快感缺失、興趣或愉悅感缺失、習得性無助、睡眠及認知功能障礙等特點[1]。在當今生活快節奏和高強度的壓力下，抑郁癥發病率正逐年上升，我國人群的抑郁癥發病率為4.2%[2]，到2020年其將成為僅次于心臟病的第二大疾患，已經成為廣受關注的公共衛生問題。

抑郁癥病因的單胺假說認為，中樞神經系統中單胺類神經遞質濃度水平下降會引起抑郁癥[3]。單胺類神經遞質主要包括5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)或去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，它們在大腦的合成速度受大腦中前體物質濃度的影響，通過飲食攝入某些神經遞質的前體可增加其在大腦中的水平。色氨酸(tryptophan，Trp)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)/酪氨酸(tyrosine，Tyr)分別是5-HT和DA的前體，它們的攝入量與抑郁的發生密切相關，通過膳食補充富含Trp和苯丙氨酸的飲食是預防抑郁發生的有效營養干預措施[4]，近年來，開發富含Trp的食品資源是該領域的研究的熱點，已經發現或應用的主要是牛乳源蛋白或肽，包括乳清蛋白、α-乳清蛋白、β-lactolin和γ-[Glu]n-Trp(乳清蛋白水解物)，它們的神經調節活性主要與5-HT系統有關。研究發現富含Trp的乳清蛋白飲食顯示對抑郁小鼠明顯的抗焦慮作用，改善小鼠的抑郁行為[5]。以蛋白百分含量計，葵花籽蛋白Trp含量高達1.75 g/100 g蛋白，且我國的葵花籽資源豐富，其大量副產物(如葵花籽粕)有待開發利用。因此在本研究中，我們與乳清蛋白作比較，探究葵花籽蛋白能否發揮類似乳清蛋白的抗抑郁作用。

生活壓力引起的抑郁可通過慢性不可預知溫和應激(CUMS)動物模型來研究。CUMS造成抑郁的機制之一是其引起海馬氧化應激[6]。研究表明，除作為神經遞質發揮作用外，5-HT也是一種強抗氧化劑，通過補充富Trp蛋白，提高大腦5-HT的產生可能也抑制氧化應激，還有待驗證。

然而目前國內外尚未有關葵花籽蛋白抗抑郁作用的研究報道。本研究采用CUMS小鼠抑郁模型，研究葵花籽蛋白預防抑郁癥的作用。本研究可為開發基于葵花籽蛋白的食品，為其在預防抑郁發生的營養干預措施的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 動物

雄性C57BL/6J小鼠40只，6周齡，體質量17～20 g，SPF級(常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，動物合格證號：201907736)。飼養于江南大學實驗動物中心，自由進食進水，相對溫度23±2 ℃，相對濕度60%±5%，12小時晝夜交替。所有實驗操作符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：JN.No20181230c0480710[281])。

1.1.2 試劑

葵花籽蛋白(洽洽食品股份有限公司，Trp：2.35 g/100 g蛋白，Phe+Tyr：14.15 g/100 g蛋白)，乳清蛋白(河南旗諾食品配料有限公司，Trp：1.22 g/100g蛋白，Phe+Tyr：6.65 g/100 g蛋白)；大豆蛋白(江蘇富盛德生物工程有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)試劑盒(南京建成生物研究所)；皮質酮(corticosterone，CORT)、5-HT、DA、NE和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)試劑盒(江蘇酶免實業有限公司)。

1.1.3 儀器與設備

動物行為學實驗裝置(上海欣軟信息科技有限公司)；MultiskanMK3酶標儀(美國Molecular Devices公司)；R686VLT超低溫冷凍冰箱(美國INVETRO公司)；5804R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將小鼠隨機分為正常組(CON，蛋白來源大豆蛋白)、模型組(MOD，蛋白來源大豆蛋白)、葵花籽蛋白組(SFSP)、乳清蛋白組(WPC)，10只/組。各組小鼠先飼喂不同蛋白源飼料(表1)4周，從第5周開始，除正常組外，其余各組小鼠單籠飼養且連續進行抑郁模型造模3周。

表1 動物飼料組成

1.2.2 慢性不可預知溫和應激模型(CUMS)

運用多種刺激方式以每天2次的頻率交替應激小鼠21天，應激[7]包括籠具45°傾斜2 h、夾尾3 min、于無墊料的籠具中4 h、同籠3 h(5只)、置于大鼠墊料3 h、空籠具加水0.8 cm淹沒4 h，以及禁水、禁食12 h。

1.3 檢測指標

1.3.1 糖水偏好實驗

糖水偏好實驗(sucrose preference test，SPT)參考文獻[8]，分為訓練期和測試期。訓練期：給予小鼠一瓶1%蔗糖水和一瓶純水48 h，中間交換水瓶位置，讓小鼠適應飲用糖水。測試期：小鼠禁水禁食12 h后進行12 h的糖水偏好測試，測試前后分別稱量每個水瓶的重量，并計算糖水偏愛指數(糖水偏愛指數 = 糖水消耗量/總液體消耗量 × 100%)，造模結束后第2天進行糖水偏好實驗。

1.3.2 懸尾實驗

懸尾實驗(tail suspension test，TST)參考文獻[9]，用膠帶把小鼠尾巴(距尾尖1 cm)粘貼在固定裝置上，使小鼠倒置，頭部距水平面大約20 cm，此外小鼠間用擋板隔開阻礙其視線，保證小鼠懸空，無可接觸地方，每只小鼠實驗時間為6 min，觀察并記錄后4 min內的累計不動時間，將小鼠除呼吸外所有肢體均不動的時間認定為不動時間。

1.3.3 強迫游泳實驗

強迫游泳(forced swimming test，FST)參考文獻[10]，將小鼠放于高25 cm，直徑15 cm的燒杯中，燒杯中的水深保持12 cm，溫度控制在25 ℃左右，將小鼠放置于水中6 min，觀察記錄小鼠在后4 min內的累計不動時間。將小鼠在水中停止游動掙扎，或呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面，身體沒有全身運動的狀態認定為不動時間。

1.3.4 曠場實驗

曠場實驗(open field test，OFT)在一個黑暗的房間里，放置一個無頂的實驗箱(40 cm×40 cm×30 cm)，在箱子上方安裝有攝像頭，并連接電腦上的ANY-maze視頻追蹤系統，自動跟蹤和記錄小鼠在實驗中的活動情況并獲得行為數據。實驗箱的底部在電腦上被分為16個小正方形格子(10 cm×10 cm)，中央區域的四個正方形格子被定義為中央區域。將小鼠放入裝置的中央區域并允許其自由探索30 min。每次實驗結束后將小鼠的糞尿殘留物清理干凈，并用 75%乙醇擦拭從而清除殘留氣味，避免殘留的氣味影響實驗結果。

1.3.5 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮實驗(elevated plus maze，EPM)將小鼠放置在長50 cm，寬5 cm的開放臂和封閉臂交叉組成的實驗裝置中，中央是無封閉的5 cm×5 cm的平臺，封閉臂和底部平臺均為白色，整個裝置距離地面45 cm，讓小鼠在裝置中自由探索5 min，與攝像頭相連的電腦系統自動記錄小鼠的活動狀態。

1.3.6 樣品采集

行為學實驗結束后，眼球取血并脫頸處死小鼠，收集血液并迅速分離皮層和海馬組織。將血液在4 ℃，4 000 rpm離心10 min，收集上層血漿分裝到離心管，-80 ℃保存。海馬和皮層按1∶10(W/V)用生理鹽水制備成組織勻漿液，離心-80 ℃保存。

1.3.7 氧化還原穩態相關指標的測定

皮層SOD、GSH-Px和CAT活性以及MDA水平的測定嚴格按照檢測試劑盒的說明進行，活性氧自由基(ROS)測定采用化學發光法測定[11]。

1.3.8 CORT和單胺類神經遞質的測定

血清CORT和海馬5-HT、DA、NE和BDNF的測定按照Elisa試劑盒說明書操作。

1.4 數據統計分析

使用IBM SPSS Statistics 20.0進行數據分析。結果表示為平均值±標準差。通過單因素方差分析(ANOVA)對結果進行分析，用Duncan檢驗進行組間比較。當P<0.05時，差異被認為是顯著的。通過雙變量相關性分析對結果進行雙側顯著性檢驗，用HemI 1.0 制作熱圖。

2 結果

2.1 SFSP對抑郁模型小鼠體重的影響

如圖1，第4周時，SFSP組體重顯著高于其余3組(P<0.05)，而CON、MOD和WPC組體重無顯著差異，可能與以SFSP配制的飼料適口性更好有關。研究發現葵花籽蛋白在促進生長、體重增長和飲食效率比方面表現更有效率[12]，與本實驗結果一致；CUMS模型施加后，第5周，除CON組外，其余各組體重出現下降趨勢，為小鼠初次遭受應激的結果，其它應激引起小鼠體重下降也曾被觀察到[13]。第6周，MOD、SFSP和WPC組小鼠體重呈現明顯升高的短暫時期，可能與小鼠對應激的暫時適應有關，這也與我們觀察到的采食量明顯增加的變化一致。與MOD相比，CON，SFSP和MOD組體重顯著增加(P<0.05)。

圖1 葵花籽蛋白對體重的影響

2.2 SFSP對抑郁模型小鼠糖水偏好的影響

如表2，與CON相比，MOD組小鼠對糖水的偏好顯著性降低(P<0.05)，表明抑郁小鼠對獎賞的反應性降低，即快感缺失；與MOD組比，SFSP組和WPC組小鼠對糖水的偏好明顯提高(P<0.05)。

表2 SFSP對抑郁模型小鼠糖水偏好的影響(n= 10)

2.3 SFSP對抑郁模型小鼠TST和FST實驗不動時間的影響

如表3，在TST和FST實驗中，與CON組相比，MOD組小鼠不動時間顯著增加(P<0.05)，表明抑郁小鼠的行為絕望狀態加重；SFSP組和WPC組小鼠與MOD組相比不動時間顯著減少(P<0.05)。

表3 SFSP對TST和FST實驗不動時間的影響(n= 10)

2.4 SFSP對抑郁模型小鼠自主活動性的影響

如表4，各組小鼠總路程無顯著性差異，但其余各組小鼠總的運動路程大于MOD組；與CON相比，MOD組小鼠進入中央區域的時間、路程和次數顯著減少(P<0.05)，表明抑郁小鼠對新環境的好奇程自主活動性降低；與MOD相比，SFSP組小鼠進入中央區域的時間、路程和次數顯著增加(P<0.05)，WPC組小鼠進入中央區域的時間和路程顯著增加(P<0.05)，進入中央區域次數無顯著性差異。

表4 SFSP對OFT實驗自主活動性的影響(n= 10)

2.5 SFSP對抑郁模型小鼠焦慮情緒的影響

如表5，與CON組相比，MOD組小鼠進入開臂的次數、停留時間和進入時間百分比顯著減少(P<0.05)，進入總次數與其無顯著性差異，驗證了抑郁小鼠的焦慮狀態加劇；與MOD組相比，SFSP組和WPC組小鼠進入總次數、開臂的次數、停留時間和進入時間百分比均顯著增加(P<0.05)。

表5 SFSP對高架十字迷宮實驗自主活動性的影響(n= 10)

2.6 SFSP對抑郁模型小鼠皮層氧化還原穩態的影響

如表6，與CON組相比，MOD組小鼠皮層內GSH-Px、SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，而MDA和ROS水平顯著升高(P<0.05)，說明氧化應激引起了抑郁小鼠體內抗氧化系統耗竭；與MOD組相比，SFSP組和WPC組小鼠皮層內GSH-Px、SOD、CAT活性顯著提升(P<0.05)，MDA和ROS水平顯著降低(P<0.05)，且SFSP組小鼠GSH-Px和SOD活性比WPC組提升更顯著(P<0.05)。

表6 SFSP對皮層氧化應激的影響(n= 10)

2.7 SFSP對抑郁模型小鼠血清CORT和海馬神經遞質含量的影響

如表7，與CON組相比，抑郁小鼠血漿中CORT含量顯著升高(P<0.05)；SFSP組和WPC組小鼠血漿中CORT含量比MOD組顯著降低(P<0.05)。

表7 SFSP對抑郁模型小鼠皮質酮和神經遞質的影響(n= 10)

與CON組相比，抑郁小鼠海馬中5-HT、DA、NE和BDNF含量顯著降低(P<0.05)；與MOD組相比，SFSP組和WPC組小鼠海馬中5-HT、DA、NE和BDNF含量顯著升高(P<0.05)，且SFSP組海馬內BDNF含量顯著高于WPC組(P<0.05)。

2.8 SFSP對抑郁模型小鼠血清氨基酸含量的影響

如表8，與CON組相比，抑郁小鼠血漿中Trp、Phe、Tyr和支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)濃度以及色氨酸與中性氨基酸(large neutral amino acids，LNAA)比值顯著降低(P<0.05)；與MOD組相比，SFSP組和WPC組小鼠血漿內Trp、Phe、Tyr和支鏈氨基酸濃度及Trp/LNAA 比值顯著提升(P<0.05)。

表8 SFSP對抑郁模型小鼠皮質酮和神經遞質的影響(n= 10)

2.9 行為學指標與生化指標相關性分析

圖2顯示，根據不同指標的相關系數聚類分析，行為學和生化指標分別都被分為4類。生化指標分類中G1以神經遞質為主、G2主要應激介質、G3主要為血清中性氨基酸，而G4為神經遞質前體氨基酸及其總量與中性氨基酸的比值。在行為學指標中，糖水偏好指數與其它指標明顯分離，與單胺、抗氧化指標和芳香族氨基酸都存在顯著相關，說明該指標是反映抑郁行為的最敏感指標。此外，懸尾實驗和強迫游泳實驗結果屬于II群與G1-G3關系密切。懸尾實驗結果也與G4相關性密切。因此，這三種行為學指標最適合于評價單胺前體的利用效率及神經調節作用。

圖2 行為學指標與生化指標相關性熱圖

3 討論

CUMS模型近年來已經成為研究嚙齒動物抑郁病理機制的經典模型之一。動物暴露于CUMS一段時間后，其抑郁行為的發展接近于人類抑郁癥臨床癥狀，如對獎賞的反應性降低(快感缺乏)，身體活動和行為發生改變(習得性無助)，毛發修飾和性行為改變[14]。目前，行為學是判定抑郁模型的主要標準，以判斷CUMS模型是否造模成功及干預是否有效。本實驗顯示CUMS誘導的小鼠體重和糖水偏好率顯著下降，SFSP和WPC顯著提升了抑郁小鼠體重和糖水偏好率。Orosco等[15]發現長期食用α-乳清蛋白的小鼠相比富含酪蛋白的飲食，對糖水的偏好明顯增加，與本研究一致。葵花籽蛋白和乳清蛋白顯著減少了懸尾和強迫游泳不動時間，預防抑郁小鼠在礦場和高架十字迷宮的焦慮行為，二者效果相當。Ahmed等[16]發現暴露于壓力源中的小鼠在懸尾和強迫游泳實驗中不動時間顯著增加，給予乳清蛋白分離物的小鼠不動時間顯著減少。研究報道[15,17]，給予富含乳清蛋白飲食的小鼠在曠場實驗中進入中央區域次數和高架十字迷宮中進入總次數，開臂次數和開臂時間百分比顯著增加，顯示抗焦慮效果。本實驗中與模型組相比，乳清蛋白組小鼠進入中央區域次數雖無顯著性差異，但進入次數多于抑郁小鼠。表明葵花籽蛋白可改善小鼠抑郁行為。

抑郁癥的發展伴隨氧化應激的發生，抑郁癥患者血漿中SOD等抗氧化因子水平顯著降低，而MDA水平顯著升高[18]。ROS在某些神經精神疾病如重度抑郁中起作用，如果ROS的濃度超過人體中和能力，會改變氧化劑和抗氧化因子之間的平衡而造成氧化損傷[19]。本研究顯示葵花籽蛋白能夠顯著提升抑郁小鼠皮層內GSH-Px、SOD和CAT活性，降低MDA和ROS濃度，其與乳清蛋白抗抑郁效果相當。研究[20]報道WPC可下調大鼠體內ROS和NO水平，防止氧化損傷的發展。表明葵花籽蛋白能夠發揮類似乳清蛋白的抗抑郁作用，通過改善小鼠皮層內氧化應激狀態，減少自由基的產生，調節體內氧化因子與抗氧化子的平衡起到改善抑郁的作用。

長期應激壓力會激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，從而導致循環中的糖皮質激素(如嚙齒類動物的CORT或靈長類動物的皮質醇)增加，皮質醇異常升高可能導致抑郁癥的發展[21]。本結果顯示CUMS誘導小鼠血漿CORT含量顯著降低，葵花籽蛋白可以逆轉其含量降低。單胺類神經遞質在抑郁癥中起著重要作用，5-HT、NE和DA等參與調節精神活動、情緒反應、睡眠和性欲等與神經系統有關的生理反應。BDNF是一種BDNF-TrkB信號轉導的突觸功能和神經可塑性的調節因子，其和神經元形成、快感缺乏癥以及學習記憶障礙等方面有關[22]。本實驗發現抑郁小鼠海馬中5-HT、DA、NE和BDNF含量顯著降低，葵花籽蛋白可明顯抑制CUMS誘導的小鼠海馬中神經遞質和BDNF水平降低，其效果與乳清蛋白效果相當。研究報道乳清蛋白分離物顯著提高抑郁小鼠體內5-HT、DA、NE，其效果與氟西汀相當[16]，這與本實驗結果一致。研究發現5-HT具有抗氧化性，是氧化應激信號通路的關鍵調節劑之一，5-HT的產生會影響ROS水平，從而來調節氧化應激[23]，這與我們的相關性分析一致，表明5-HT與氧化應激存在相關性。表明葵花籽蛋白可能通過調節單胺類神經遞質減少和改善單胺能神經元功能不足，增強大腦神經可塑性而發揮抗抑郁作用。

Trp進入大腦的轉運是由亮氨酸偏愛的L型氨基酸轉運載體1系統介導的，Trp/LNAA的比例決定了Trp進入大腦的流量，從而決定5-HT的生物合成，被認為是腦Trp可用性的敏感指數[24]，增大Trp/LNAA 比率，可以促進Trp穿過血腦屏障進入大腦，合成神經遞質5-HT，參與情緒調節。本結果顯示抑郁小鼠血清中Trp、Phe、Tyr濃度及Trp/LNAA比值明顯低于正常組，給予葵花籽蛋白和乳清蛋白可顯著抑制CUMS誘導的小鼠血清中Trp濃度和Trp/LNAA比值的降低。Markus等[25]報道，受試者服用α-乳清蛋白可增加血漿中Trp及Trp/LNAA的比例，并可能通過改變腦內血清素的含量來提高應對能力。提示葵花籽蛋白可能通過調節Trp濃度以及Trp/LNAA比值，促進Trp進入大腦，增強5-HT的合成和釋放而發揮抗抑郁作用。

綜上，葵花籽蛋白可顯著改善抑郁，活性與乳清蛋白相當，主要通過改善抑郁模型小鼠大腦氧化應激損傷和提高單胺類神經遞質濃度而實現。但是，以葵花籽蛋白為主要食物蛋白來源在在現實中難以實現，目前國外市場主要的富含葵花籽蛋白的產品是葵花籽醬，但我國消費比較少。有研究顯示，蛋白水解物比完整或純Trp能更明顯、更快和更持久的增加大腦Trp[26]。因此，下一步研究需要集中于葵花籽富含Trp的水解物組分的鑒定，開發相應的食品配料，用于少量攝取即可發揮預防抑郁的作用。