丁烯酸內酯二萜衍生物的制備及抗腫瘤活性研究

左笑菲，楊 帆，張曉梅，陳凌云，趙 慶

云南中醫藥大學中藥學院，昆明 650500

二萜成分在姜科姜花屬植物中廣泛存在，其中部分二萜具有顯著的細胞毒、抗腫瘤等生物活性[1-3]。本課題組對該屬植物二萜進行了系統的研究，從滇姜花、圓瓣姜花和毛姜花[4-7]中分離得到一些對多種腫瘤細胞具有顯著體外細胞毒活性的二萜成分。對滇姜花的粗提物、二萜成分滇姜花素A和hedychenone進行了小鼠體內抗腫瘤活性測試，結果表明它們均能顯著性抑制小鼠體內移植性腫瘤H22的生長，其中滇姜花素A對H22腫瘤生長抑制率較高，為54.27%[4]。進一步的研究表明，化合物滇姜花素C、7-hydroxy-hedychenone對小鼠體內移植性腫瘤H22的生長也具有顯著的抑制作用[8]。前期工作還表明，具有丁烯酸內酯結構的二萜成分對多種腫瘤細胞大多具有較高的體外細胞毒活性。例如呋喃二萜coronarin E沒有細胞毒活性；但如果將coronarin E氧化，得到的一個具有γ-羥基丁烯酸內酯結構單元的二萜(4，圖1)對五種腫瘤細胞株具有不同程度的細胞毒活性[6]。據此初步推測：具有呋喃型二萜成分呋喃環轉化為具有丁烯酸內酯結構的衍生物，有可能提高其細胞毒活性。雖然呋喃二萜轉化為丁烯酸內酯型二萜通常可以提高其體外細胞毒活性，但其體內抗腫瘤活性是否也同時提高，需要進一步探討。因此，我們的后續工作以二萜coronarin E、hedychenone和滇姜花素A[9]為原料進行結構改造，制備了三個具有γ-羥基丁烯酸內酯結構的衍生物，并對這三個產物進行了對小鼠體內移植性腫瘤H22和S180的抗腫瘤活性測試。

1 材料與方法

1.1 材料

核磁共振氫譜、碳譜由BrukerAM-400超導型核磁共振儀測定。柱色譜硅膠(300～400目)和硅膠H(青島海洋化工廠)。薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠)，薄層顯色的常規方法為：5%硫酸-乙醇溶液在150 ℃下烘烤顯色明顯。

二萜成分coronarin E(1)、hedychenone(2)、滇姜花素A(3)均由云南中醫藥大學趙慶課題組提供。

H22細胞株(江陰齊式生物科技有限公司)。S180細胞株(昆明動物研究所細胞庫)。清潔級ICR小鼠共100只，雌雄各半，體重18～21 g，由昆明醫科大學實驗動物中心提供(編號SCXK(滇)K2015-0002)。白血病細胞株HL-60、肝癌細胞株SMMC-7721、肺癌細胞株A-549、乳腺癌細胞株MCF-7和結腸癌細胞株SW480均由中國科學院昆明植物研究所分析測試中心提供。

1.2 三個二萜成分的結構改造

1.2.1 Coronarin E(1)的光敏氧化反應制備化合物4

Coronarin E(1)光敏氧化制備化合物4參見文獻[10]：取1.00 g coronarin E(1)，溶于250 mL干燥的二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，加入20 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌，在-45 ℃及LED燈照射下反應6 h，TLC檢測原料反應完全。蒸干溶劑，殘余物經硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫，得到化合物4[10](0.81 g，白色粉末，產率73%)，其化學結構如圖1所示。

圖1 化合物1的光敏氧化

1.2.2 Hedychenone(2)的光敏氧化反應制備化合物5

取hedychenone(2)1.00 g，溶于250 mL干燥的二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，加入20 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌，在-45 ℃及LED燈照射下反應6 h，TLC檢測原料反應完全。蒸干溶劑，殘余物經硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯2∶1洗脫，得到化合物5(0.74 g，白色粉末，產率為67%)。化合物5的1H NMR和13C NMR數據與姜科植物草果藥(Hedychiumspicatum)中發現的二萜成分spicatanol[11]一致，由此確定化合物5為spicatanol。

圖2 化合物2的光敏氧化

1.2.3 滇姜花素A(3)的酰化與光敏氧化反應制備化合物7

稱取滇姜花素A(3)2.30 g，溶解于15 g吡啶，緩慢加入苯甲酰氯10 g，在100 ℃下加熱3 h，在常溫下再靜置兩天。將反應液傾入200 mL 5%碳酸鈉溶液中，攪拌2 h。用乙酸乙酯萃取兩次(200 mL×2)，萃取液合并后，用10 %磷酸二氫鈉水溶液洗滌三次(50 mL×3)。乙酸乙酯層用無水Na2SO4干燥24 h，濃縮回收。用硅膠柱色譜分離，石油醚：乙酸乙酯(60∶1→10∶1)洗脫。得化合物6(1.40 g，產率40%)。

稱取化合物61.00 g，溶于250 mL無水二氯甲烷中，加入5 mLN，N-二異丙基乙胺，10 mg四苯基卟啉(TPP)，通入氧氣并攪拌。在-45 ℃及LED燈照射下反應7 h，TLC檢測原料反應完全。反應液濃縮回收，殘余物用二氯甲烷溶解，經硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(2∶1)洗脫，得到化合物7(0.47 g,產率31.5%)。7為白色無定形粉末，無明確熔點。根據反應機理，7的結構式應如圖3所示，該結構與高分辯質譜確定的分子式C27H32O5相吻合，也與NMR數據相符。7與文獻報道的二萜滇姜花素C[12]結構相似，差別僅在于：7的C-6位為β-羥基取代，而滇姜花素C的C-6位為β-苯甲酰氧基取代。因此,7的二萜結構單元1H NMR、13C NMR數據與滇姜花素C很相似，將二者的NMR數據對比，即可對7的二萜結構單元的NMR數據進行歸宿。再采用軟件Chemdraw對7的苯甲酰氧基部分的1H NMR和13C NMR進行預測，根據預測的結果與實測結果對照，可對分子中的甲酰氧基結構單元的NMR數據進行歸屬。

圖3 化合物7的制備

1.3 化合物1、2、5、6和7的體外細胞毒活性測試

采用MTT法[13,14]，測定化合物1、2、5、6和7對五個腫瘤細胞株的體外細胞毒活性。陽性對照采用順鉑。

1.4 小鼠體內抗腫瘤實驗

清潔級ICR小鼠共100只，雌雄各半，體重18～21 g。每次實驗采用50只小鼠，將小鼠隨機分為5組，分別為陰性對照組、陽性對照組、化合物4組、化合物5組和化合物7組，每組10只小鼠，雌雄各半。小鼠在適應性喂養2天后，于左前肢皮下接種新鮮的H22(或者S180)腫瘤細胞懸液(0.1 mL/鼠，1×106細胞)。在接種腫瘤細胞后的第2日開始按分組給藥。陰性對照組腹腔注射給予DMSO，陽性對照組給予異環磷酰胺，其它各組給予相應的待測物。每天給藥1次，于給藥的第7天將動物脫臼處死，完整剝離腫瘤并在電子稱稱腫瘤重量及腫瘤剝離后的動物體重。比較分析各組腫瘤重量及瘤重抑制率。

瘤重抑制率=(陰性對照組腫瘤平均重量(g)-樣品組腫瘤平均重量(g))/陰性對照組平均腫瘤重量(g)×100%

2 結果與分析

2.1 新化合物的波譜數據

化合物7HR-ESI-MS：m/z475.188 4[M+K]+(calcd for C27H32O5K+，475.188 7)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-18)，1.25(3H，s，H-19)，1.38(3H，s，H-20)，4.60/4.69(1H，H-17a)，5.77(1H，s，H-17b)，4.62(1H，s，H-6)，5.88(1H，s，H-16)，6.29/6.68(1H，s，H-14)，6.36(1H，d，J= 15.9 Hz，H-12)，6.68～6.74(1H，m，H-11)，7.43～7.47(2H，m，H-4′)，7.55～7.58(1H，m，H-5′)，8.02～8.05(2H，m，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：42.2(t，C-1)，19.1(t，C-2)，43.3/43.4(t，C-3)，34.4(s，C-4)，55.8(d，C-5)，71.1(d，C-6)，44.0(t，C-7)，144.2(s，C-8)，62.3(d，C-9)，40.5/40.4(s，C-10)，142.9(d，C-11)，115.9(d，C-12)，144.0(s，C-13)，142.8(d，C-14)，171.2(s，C-15)，97.6/97.7(d，C-16)，111.7/112.1(t，C-17)，33.4(q，C-18)，23.6(q，C-19)，18.1/18.2(q，C-20)，166.2(s，C-1′)，130.5(s，C-2′)，129.6(d，C-3′)，128.5(d，C-4′)，133.0(d，C-5′)。

2.2 化合物1、2、5、6和7對五種腫瘤細胞株的細胞毒活性

采用MTT法[13,14]測定化合物1、2、5、6和7對五種人腫瘤細胞株的細胞毒活性，測試結果見表1。化合物5和7對五種腫瘤細胞株均具有顯著的細胞毒活性，這兩個化合物對肝癌細胞株SMMC-7721、肺癌細胞株A-549、乳腺癌細胞株MCF-7和結腸癌細胞株SW480的抑制活性均超過陽性對照順鉑。此外，我們的前期研究工作已表明，化合物4對五種腫瘤細胞株亦具有不同程度的細胞毒活性[6]。

表1 化合物1、2、5、6和7對五種人腫瘤細胞的半抑制濃度IC50

2.3 化合物4、5及7對小鼠體內H22腫瘤細胞生長的抑制活性

體內抗腫瘤實驗結果見表2和圖4。小鼠的體重，瘤重均數采用t檢驗進行統計分析。

圖4 化合物4、5、7和異環磷酰胺對H22荷瘤鼠腫瘤的影響

表2 小鼠體內抗H22腫瘤實驗研究結果

2.4 化合物4、5及7對小鼠體內S180腫瘤細胞生長的抑制活性

體內抗腫瘤實驗研究結果見表3和圖5。小鼠的體重，瘤重均數采用t檢驗進行統計分析。

圖5 化合物4、5、7和異環磷酰胺對S180荷瘤鼠腫瘤的影響

表3 小鼠體內抗S180腫瘤實驗研究結果

對小鼠體內移植性腫瘤H22和S180抑制活性研究結果表明，化合物4、5及7均顯示了明顯的體內抑瘤活性，其中4對H22體內抑瘤活性較強，抑制率接近陽性對照藥物異環磷酰胺。化合物4、7對小鼠肉瘤細胞S180的體內抑瘤活性較強，抑制率均超過陽性對照藥物異環磷酰胺。

3 討論

采用三個姜科二萜成分1、2和3經結構改造，得到的三個具有γ-羥基丁烯酸內酯結構的衍生物4、5和7，它們不僅對五種人類腫瘤細胞株有很好的體外細胞毒活性，而且對小鼠體內移植性腫瘤H22和S180的生長均具有顯著的抑制作用。呋喃型二萜1和2均未顯示細胞毒活性，而它們在氧化后得到的γ-羥基丁烯酸內酯型二萜4[6]和5均具有顯著的細胞毒活性。在前期工作中，二萜coronarin E(1)對小鼠體內移植性腫瘤H22未顯示抗腫瘤活性[8]；但是其氧化后得到的化合物4，對小鼠體內移植性腫瘤H22和S180生長的抑制作用較強。化合物5和7的抗腫瘤活性也較強。這說明，將姜科的二萜類成分改造為具有γ-羥基丁烯酸內酯結構的衍生物，有可能提高其抗腫瘤活性。從具有丁烯酸內酯結構單元的二萜成分中尋找有苗頭的抗腫瘤活性成分或先導化合物，可作為未來抗腫瘤藥物的一個研究方向。