宮頸上皮病變的聯(lián)合診斷價(jià)值分析

張梅芳 吳東恩 胡蕾蕾

臨床各種婦科腫瘤中，宮頸癌發(fā)病率位于前列，該腫瘤常見(jiàn)的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌，需要經(jīng)過(guò)幾年或者幾十年來(lái)完成從正常上皮到宮頸上皮病變（cervical intra epithelial neoplasia，CIN），再到宮頸浸潤(rùn)癌的演變。宮頸癌的早期診斷及治療在醫(yī)學(xué)界中一直備受關(guān)注，為了對(duì)該病及時(shí)采取預(yù)防及治療，目前臨床上主要面臨的問(wèn)題是宮頸癌前病變（主要為宮頸上皮病變）的準(zhǔn)確診斷[1]。宮頸上皮病變主要根據(jù)組織學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行診斷和分級(jí)，但不能排除觀察者有時(shí)對(duì)組織切片誤解、組織變異及其他因素的影響，使宮頸上皮病變的診斷及分級(jí)準(zhǔn)確度不高。因此需要找到更有說(shuō)服力的病理診斷證據(jù)，有研究指出[2]，相關(guān)標(biāo)志物在宮頸癌前病變階段診斷中具有良好應(yīng)用價(jià)值，利于及早防治該疾病。有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道[3]，宮頸病變進(jìn)展過(guò)程中，有望將Ki67、P16～（INK4a）作為重要標(biāo)志物。基于此，本研究中以各種級(jí)別CIN組織作為研究對(duì)象，對(duì)其行石蠟包埋處理，同時(shí)經(jīng)免疫租花對(duì)CIN中Ki67、P16～（INK4a）表達(dá)差異進(jìn)行觀察，分析與病變程度的相關(guān)性，以為提高臨床上CIN的診斷準(zhǔn)確性提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2017年12月于我院經(jīng)病理診斷為CIN的患者90例，年齡21～65歲，平均年齡（45.35±4.73）歲。所有患者的宮頸組織切片均經(jīng)專業(yè)的病理醫(yī)生進(jìn)行復(fù)查確認(rèn)，均行石蠟包埋。將CIN標(biāo)本分級(jí)，CIN Ⅰ級(jí)34例，CIN Ⅱ級(jí)26例，CIN Ⅲ級(jí)30例，CIN Ⅰ級(jí)患者年齡21～65歲，平均年齡（45.39±4.71）歲，CIN Ⅱ級(jí)患者年齡22～63歲，平均年齡（45.12±4.65）歲，CIN Ⅲ級(jí)患者年齡24～63歲，平均年齡（45.28±4.61）歲，三組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。研究獲得醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者術(shù)前均未接受放化療，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 所用試劑 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司生產(chǎn)的免疫組化染色試劑盒；Ventana Bench Mark XT（瑞士，羅氏）生產(chǎn)的全自動(dòng)免疫組化儀器；Ki67與 P16～（INK4a）鼠抗人單克隆抗體；將已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。

1.2.2 取常規(guī)固定包埋的石蠟組織塊標(biāo)本 采用4%的中性甲醛將全部標(biāo)本固定好，脫水之后進(jìn)行石蠟包埋，行連續(xù)切片（3張，每張3 μm），其中1張的用途為HE染色，1張用途為Ki67免疫組化染色，1張用途為P16～（INK4a）免疫組化染色，具體染色流程為：（1）將石蠟切片厚度控制為4～5 μm，放置在烤片機(jī)（溫度為65℃）中，時(shí)間控制為60 min，將標(biāo)簽粘貼于烤片機(jī)之后，將其放置在機(jī)器切片盤(pán)上。（2）在檢測(cè)試劑架前放置各種試劑瓶，包括一抗、返藍(lán)液、DAB試劑盒等。（3）染色時(shí)，先進(jìn)行消化，然后再孵育抗體，最后進(jìn)行復(fù)染，總時(shí)間控制在4 h之內(nèi)。（4）采用含有清潔劑的清水對(duì)切片進(jìn)行仔細(xì)重沖洗，然后再行梯度乙醇脫水操作，采用中性樹(shù)脂膠將其封固。（5）內(nèi)對(duì)照對(duì)象選擇癌旁組織，同時(shí)需要設(shè)置陽(yáng)性、陰性對(duì)照[4]。

1.3 觀察指標(biāo)

由1位專業(yè)性強(qiáng)的病理醫(yī)生對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，并要求其在在無(wú)臨床信息和HE切片診斷的情況下進(jìn)行。P16～（INK4a）在胞核伴胞質(zhì)或者細(xì)胞核中進(jìn)行表達(dá)，Ki67則表達(dá)于細(xì)胞核中；以染色分布情況與強(qiáng)度為依據(jù)，獲得半定量報(bào)告，可將染色程度分為棕黃色（+++）、黃色（++）、淡黃色（+）三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；以染色分布情況為依據(jù)，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行計(jì)算：在高倍鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選擇10個(gè)視野（不重復(fù)），各視野均有10個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將其平均值當(dāng)成陽(yáng)性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)，具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：P16～（INK4a）陽(yáng)性細(xì)胞小于5%，則可將其判定為陰性（-），若在5%～25%之間，則可判定為（+），若在＞25%～75%之間，則可判定為（++），若在75%以上，則可判定為（+++），若著色部位只有胞質(zhì)，同時(shí)只有小簇細(xì)胞著色，則可將其判定為陰性。若Ki67陽(yáng)性表達(dá)只在基底旁層或者上皮基底，則可將其判定為陰性（-），若＞基底層10%～25%，則可判定為（+），若＞25%～75%之間，則可判定為（++），若超過(guò)75%，則可判定為（+++）。

分析P16～（INK4a）和Ki67在不同級(jí)別CIN中的表達(dá)，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析P16～（INK4a）和Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸病變級(jí)別的相關(guān)性。

表1 P16～（INK4a）和Ki67在宮頸CIN Ⅰ～CIN Ⅲ中的表達(dá)（例）

表2 P16INK4a和Ki67之間的關(guān)聯(lián)性

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料用例表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（±s）表示，變量間的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P16～（INK4a）和Ki67在不同級(jí)別CIN中的表達(dá)

P16～（INK4a）、Ki67的陽(yáng)性表達(dá)率隨CIN級(jí)別升高而升高，兩者在CIN Ⅰ～Ⅲ級(jí)中的陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 P16～（INK4a）和Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸病變級(jí)別的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P16～（INK4a）陽(yáng)性表達(dá)率均與CIN病變級(jí)別呈正相關(guān)（r1＝0.703，P＜0.05）；Ki67陽(yáng)性表達(dá)率均與CIN病變級(jí)別亦呈正相關(guān)（r2＝0.697，P＜0.05）。

2.3 P16INK4a和Ki67之間的關(guān)聯(lián)性

在CINⅠ～Ⅲ中P16～（INK4a）與Ki67的陽(yáng)性表達(dá)具有相關(guān)性（r＝0.715，P＜0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

P16～（INK4a）是一種抑癌基因，能直接控制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的表達(dá)。相關(guān)研究指出，P16～（INK4a）在CIN II和CIN III中的表達(dá)率明顯高于CIN Ⅰ，提示了P16～（INK4a）有望利用于分LSIL和HSIL的區(qū)分[5]。本研究結(jié)果顯示，P16～（INK4a）的陽(yáng)性表達(dá)率隨著CIN分級(jí)的增高而逐漸增高，相較于LSIL，HSIL強(qiáng)陽(yáng)性、陽(yáng)性百分比更高，且P16～（INK4a）陽(yáng)性表達(dá)和宮頸上皮病變之間存在正相關(guān)性（r＝0.703，P＜0.05）。說(shuō)明P16～（INK4a）的陽(yáng)性表達(dá)可以作為高級(jí)別CIN的特異性標(biāo)志物，提高其診斷準(zhǔn)確性，從而為宮頸癌前病變的早期診斷及治療提高可靠依據(jù)，并可用來(lái)評(píng)估宮頸癌前病變的發(fā)展情況[6-7]。

Ki67屬于一種細(xì)胞增殖活性相關(guān)抗體，主要在細(xì)胞核中進(jìn)行表達(dá)，當(dāng)其表達(dá)為陽(yáng)性時(shí)，能對(duì)細(xì)胞增殖活躍度進(jìn)行有效反映，也可用來(lái)評(píng)估腫瘤細(xì)胞的增殖能力[8]。本研究顯示，不同級(jí)別CIN中的Ki67陽(yáng)性表達(dá)差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HSIL中陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性百分率也顯著高于LSIL，而且Ki67的陽(yáng)性表達(dá)與宮頸上皮病變嚴(yán)重程度存在正相關(guān)關(guān)系（r＝0.697，P＜0.05），提示Ki67可以用于指導(dǎo)宮頸癌前病變的早期鑒別診斷及治療。

有研究發(fā)現(xiàn)[9]，單獨(dú)用Ki67診斷宮頸病變雖然漏診率小，但存在較高的誤診率。多種生物標(biāo)記物在CIN的發(fā)展過(guò)程中起到了協(xié)同作用。P16～（INK4a）和Ki67的免疫組化染色在CIN中都具有輔助分級(jí)診斷的意義，本研究結(jié)果顯示P16～（INK4a）與Ki67的陽(yáng)性表達(dá)具有相關(guān)性（r＝0.715，P＜0.05）。對(duì)P16～（INK4a）和Ki67進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，可以分子生物學(xué)水平為依據(jù)，對(duì)癌變細(xì)胞級(jí)別進(jìn)行客觀評(píng)估，因此將兩者聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)可以有效提高診斷的準(zhǔn)確率，并作為評(píng)估CIN發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預(yù)后的指標(biāo)，從而避免了一些不必要的治療，減少手術(shù)和日后妊娠的相關(guān)并發(fā)癥，減輕患者的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)[10-12]。

綜上所述，P16～（INK4a）和Ki67聯(lián)合免疫組化檢測(cè)能有效提高宮頸上皮病變病理學(xué)診斷的一致性和準(zhǔn)確性，同時(shí)結(jié)合組織學(xué)檢查，能更好地提高篩查的準(zhǔn)確性，有助于個(gè)體化治療方案的制定。