酶法自茶葉中提取茶多酚工藝和口味研究

李映　陳佳蕓　吳亞楠　聞雪暢　葛喜珍

[摘 要]目的：探討酶法對茶葉和茶葉渣中茶多酚提取效果及口味的影響。方法：設計單因素及正交試驗，使用纖維素酶和果膠酶酶解茶葉和茶葉渣，紫外分光光度法和HPLC法檢測茶多酚含量，HPLC法檢測氨基酸含量，評價提取液口味。結果：酶法提取最佳條件為復合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，酶解pH 5.6，提取溫度60 ℃，提取時間75 min。酶法自茶葉和茶葉渣提取茶多酚產率分別為23.36%、10.38%，與不加酶相比分別提高55.94%、15.46%;酶法自茶葉和茶葉渣提取氨基酸產率分別為4.98%、3.12%，與不加酶相比分別提高20.42%、25.32%;茶葉加酶處理得到氨基酸含量高、收斂強度和苦味弱，總體接受度與氨基酸含量一致。結論：酶法可高效提取茶葉有效成分，茶葉渣可作為原料提取茶多酚，用于食品工業。

[關鍵詞]茶葉;茶葉渣;茶多酚;口味

[中圖分類號]TS 272[文獻標志碼]A[文章編號]1005-0310（2020）03-0077-06

0 引言

作為世界三大飲品之一，茶葉具有較高的營養和藥用價值。茶葉富含茶多酚、氨基酸、多糖、維生素等物質。茶多酚有抗癌、抗衰老、降血糖、抗輻射等作用;氨基酸具有鮮味，如酸、甜等[1-2]。茶多酚和氨基酸普遍用于食品加工行業。茶葉中茶多酚的提取方法包括溶劑萃取法、超聲波提取法、微波提取法、離子沉淀法、樹脂吸附法和酶法等，其中酶法提取安全、溫和、環保、效率高、簡潔[3]。本研究基于酶法從茶葉和茶葉渣中提取茶多酚和氨基酸，并檢測其味質，探討酶法提取對茶多酚、氨基酸和提取物口味的影響，以及探究自茶葉或茶葉渣中提取茶多酚的高效、環保生產工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原料：綠茶購自山東日照天潤茶業有限公司，茶葉渣（用100 ℃水浸泡茶葉30 min，連續沖泡3遍，烘干茶葉，得茶葉渣）;纖維素酶（400 U/mg）、果膠酶（500 U/mg）由上海瑞永生物科技有限公司提供;乙醇、茚三酮、氯化亞錫、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉（北京化工廠，分析純）;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（北京益利精細化學品有限公司，分析純）;標準品：表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標準品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準品、表兒茶素（EC）標準品、沒食子酸（GA）標準品、標準氨基酸（異亮氨酸）均購自國家標準物質中心;咖啡堿（CAF）標準品購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.2 儀器設備

分光光度計（上海奧析科學儀器有限公司）;LC-16高效液相色譜儀（島津儀器（蘇州）有限公司）;Waters 2695 高效液相色譜儀（Empower 工作站）;PHS-3CpH計（上海精密科學儀器有限公司）;JM-A6002電子天平（諸暨市超澤衡器設備有限公司）;HCP-500 A高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）;TG16臺式高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）。

1.3 茶多酚提取工藝

取茶葉或茶葉渣，將復合酶溶液加入茶葉或茶葉渣、酶解;加乙醇溶液提取，提取物過濾，離心，得上清液;檢測上清液中茶多酚和氨基酸含量，計算茶多酚和氨基酸提取率，同時評估口味。

1.4 單因素試驗

1.4.1 酶用量（復合酶占茶葉質量百分比）篩選

配制復合酶水溶液（根據預試結果纖維素酶、果膠酶各2.0 mg/mL）。稱取茶葉1.0 g于三角瓶，加入復合酶溶液（1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0%），加水至60 mL，調pH=5.4，溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，探討不同酶用量對茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.2 料液比（茶葉質量與提取劑體積比）篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，加1.2%的復合酶，加水至60 mL，調pH=5.4，溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇（料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL），50 ℃提取60 min，探討不同料液比對茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.3 酶解pH篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復合酶用量1.2%，加水至60 mL，調pH（3.8、4.4、5.0、5.6、6.2、6.8），溫度45 ℃，酶解300 min。加75%乙醇至100 mL，50 ℃提取60 min，料液比為1∶10 g/mL，探討不同pH對茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.4 提取溫度篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH為5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃提取60 min，料液比為1∶10 g/mL，探討不同提取溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）對茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.4.5 提取時間篩選

稱取茶葉1.0 g于三角瓶，復合酶用量1.2%，加水至60 mL，酶解pH為5.4，酶解300 min。加75%乙醇，50 ℃，料液比為1∶10 g/mL，探討不同提取時間（15、30、45、60、75、90 min）對茶葉中茶多酚提取率的影響。

1.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，進行4因素3水平的L9（3）4正交設計試驗。分別以茶葉和茶葉渣為原料，以復合酶用量（A）、料液比（B）、提取溫度（C）和提取時間（D）為因素，以茶多酚提取率為指標，利用Latin正交試驗設計軟件進行數據分析，建立酶法自茶葉、茶葉渣中提取茶多酚的最優工藝參數，見表1。

1.6 驗證試驗

以不加酶為對照，分別用茶葉和茶葉渣為底物，利用正交試驗所得最佳條件提取茶多酚和氨基酸，用酒石酸亞鐵比色法和高效液相色譜法測定茶多酚提取率，高效液相色譜法測定氨基酸含量。

1.6.1 茶葉中茶多酚含量測定

將提取液冷卻至室溫，過濾，取濾液，3 600 r/min離心10 min，取上清，根據國標GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測定》中的酒石酸亞鐵比色法來測定提取液中茶多酚含量。精確吸取1 mL待測液于25 mL容量瓶，加入5 mL酒石酸亞鐵溶液和4 mL蒸餾水，混合搖勻，再滴加pH 7.5的磷酸鹽緩沖溶液定容，以空白溶液作參比，在540 nm的波長下測量吸光度A。

1.6.2 兒茶素和咖啡堿含量檢測

對照品制備：分別稱量表兒茶素沒食子酸酯（ECG）標準品、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子酸（GA）、咖啡堿（CAF）標準品，用三蒸水定容。ECG、EGCG和CAF的質量濃度均為2 mg/mL，GA質量濃度 0.1 mg/mL，備用。兒茶素和咖啡堿用高效液相色譜法（HPLC）測定：ZORBAX SB-C18 ODS色譜柱，5 μm，4.6 mm×150 mm，柱溫：35 ℃，流動相為30%甲醇加0.5‰ H3PO4;進樣量：10 μL，流動相流速1 mL/min，紫外檢測器λ=284 nm。供試茶葉或茶葉渣提取液，冷卻至室溫，過濾，濾去反應體系中的茶粉或茶渣，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，待測。

1.6.3 氨基酸含量檢測

氨基酸組分含量測定參考尹軍峰等方法[4]。采用Waters 高效液相色譜儀檢測，Empower 軟件工作站， Agilent G1 321 A熒光檢測器，激發波長（Ex）：250 nm，發射波長（Em）：395 nm，AccQ-Tag 氨基酸（15 mm×3.9 mm×4.6 mm），流速：1 mL/min，柱溫：27 ℃，進樣量：10 μL，流動相A（乙腈∶水=60∶40），流動相B（乙腈∶磷酸鹽緩沖液=10∶90，0.013 mol/L的磷酸鹽緩沖液pH 8.1），檢測波長： 360 nm。梯度洗脫（0～2 min，A∶B=0∶100;2～15 min，A∶B=20∶80;15～30 min，A∶B=30∶70;30～40 min，A∶B=80∶20;40～45 min，A∶B=100∶0），用外標法定量氨基酸組成的含量。

1.6.4 茶多酚提取率計算

茶多酚提取率用茶葉干物質的質量百分比表示，根據國標GB/T 8313—2002《茶 茶多酚測定》中的酒石酸亞鐵比色法，用以下公式計算：

茶多酚提取率=A×1.957 ×21 000×L1L2×M×m×100%。

其中，L1為試液的總量（mL）;L2為測定時的用液量（mL）;M為試樣的質量（g）;m為試樣的干物質含量（%）;A為吸光度。

1.7 口味評定

口味評估由7位訓練有素的專家（男4名，女3名，35～56歲）組成，樣品在室溫（約25°C）下提供，每個小組成員對口味屬性（苦味、收斂性、鮮味和接受程度）進行評分。采用十分制，其中8～10為“極強”，6～8為“強”，4～6為“中性”，2～4為“弱”，0～2為“極弱”。對結果進行統計分析，確定不同樣本得分差異，每個評估在不同的日期重復3次[5]。

2 試驗結果及分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量對茶多酚提取率的影響

由圖1可知，復合酶含量在0～1.2%范圍，底物和酶充分接觸，隨酶量增加茶多酚提取率提高;當復合酶用量大于1.2%時，茶多酚提取率下降，推測復合酶飽和后，酶解反應效率下降，故復合酶添加量以1.2%為宜。

2.1.2 料液比對茶多酚提取率的影響

由圖2可知，當料液比在1∶6～1∶10 g/mL時，有助于茶多酚向溶劑轉移，當料液比超過 1∶10 g/mL時，溶劑用量增加，浸出物被稀釋，后續濃縮、干燥成本增加，故最佳料液比為1∶10 g/mL。

2.1.3 酶解pH對茶多酚提取率的影響

由圖3可知，隨酶解pH增加，茶多酚提取率先升后降，復合酶pH值為5.6時酶解作用最強，當pH偏離最佳值時，酶活中心的部分基團離子發生變化，酶活性減弱;當pH大大偏離最佳值時，酶蛋白結構改變、變性失活，茶多酚提取率隨之降低。

2.1.4 提取溫度對茶多酚提取率的影響

由圖4可知，隨酶解溫度升高，茶多酚的提取率增高，適當升溫能有效破壞細胞壁，促進胞內物質滲出，當溫度達50 ℃后，繼續升溫，酶失活，故最佳酶解溫度為50 ℃。

2.1.5 提取時間對茶多酚提取率的影響

由圖5可知，在30～90 min范圍內，隨提取時間延長，茶多酚提取率提高，提取60 min后，茶多酚含量增加偏緩，提取時間太長，茶葉中有效成分可能會發生轉化，一些酶解產物例如酚類、單寧、花色素，可成為纖維素酶的抑制劑，且隨提取時間延長，提取成本增加，適宜的提取時間為60 min。

2.2 正交試驗方案與結果

正交試驗結果見表2，正交試驗數據分析見表3。

據正交結果，各因素影響茶多酚得率的主次排列如下：料液比 B>提取時間 D>提取溫度 C>酶用量A，最佳組合為A2B2C2D3，即復合酶用量2.4%，料液比1∶10 g/mL，提取溫度60 ℃，提取時間75 min。

2.3 驗證試驗

2.3.1 不同提取方法對游離氨基酸和茶多酚提取率的影響

由表4可知，在茶葉或茶葉渣提取體系中加入復合酶，采用最佳工藝參數提取，茶多酚提取率分別為23.36%、10.38%，與不加復合酶比較，分別提高55.94%、15.46%;氨基酸提取率分別為4.98%、3.12%，與不加復合酶比較，分別提高20.42%和25.32%。

2.3.2 提取液中兒茶素及咖啡堿含量

表5高效液相色譜（HPLC）檢測結果表明，與茶葉或茶葉渣不加酶比較，用復合酶酶解，表兒茶素沒食子酸酯（ECG增加12.13%、3.70%）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG增加10.69%、2.42%）、咖啡堿（CAF增加8.31%、4.35%）的提取量均有不同程度的增加，且酶解未發現有新成分。色譜未檢測到沒食子酸（GA）。另外，茶葉經開水浸泡后茶葉渣中尚含大量茶多酚，通過酶法提取可以將其中的有效成分提取，避免資源浪費。

2.4 不同處理對提取液口味的影響

由表4、圖6看出，茶葉加酶處理游離氨基酸含量最高，其他依次是茶葉不加酶、茶葉渣加酶、茶葉渣不加酶;總體接受度同游離氨基酸含量一致，即氨基酸含量越高被接受程度越高;收斂強度和苦味由強到弱依次是：茶葉渣不加酶、茶葉渣加酶、茶葉不加酶和茶葉加酶。

3 討論與結論

茶多酚的溶劑萃取法純化難度大;超聲波提取利用超聲波與媒介物質互相作用，發生機械及空穴作用，破壞茶葉細胞壁，加速細胞中活性物質的溶出，其缺點是設備費用高[6];微波提取利用不同物質在微波場中吸收微波能力不同，待提取成分被選擇性加熱時，與提取體系分離，進入吸收微波能力較差的提取劑中，提取成本高;離子沉淀法利用茶多酚與一些重金屬離子發生絡合形成沉淀，將金屬離子作沉淀劑，從混合物中分離純化得高純度茶多酚，此法重金屬可對產品造成二次污染;樹脂吸附法利用樹脂選擇性吸附茶多酚成本高、費時費力[7]。本研究表明，酶法自茶葉或茶葉渣中提取茶多酚的提取率比不加酶分別提高55.94%和15.46%，HPLC法檢測結果，茶多酚提取率較比色法提高幅度小，因茶多酚的主要成分是黃烷酮類、花色素類、黃酮醇類、花白素類和酚酸及縮酚酸類化合物，其中黃烷酮類（兒茶素類化合物）占茶多酚總量的60%～80%，其次是黃酮類、酚類。茶多酚是混合物，兒茶素是其中的一類物質，高效液相色譜法測定兒茶素雖能反映茶多酚的提取率高低，但不能完全檢測茶多酚中所有成分的變化，從總趨勢推斷，纖維素酶和果膠酶作為復合酶浸提茶多酚是一種有效的提取方式[3]。

結果表明，酶法提取兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡堿和游離氨基酸的含量均有不同程度的增加。兒茶素分酯型與非酯型，酯型兒茶素收斂性強，主要對茶湯苦澀味起作用，而非酯型兒茶素具有先苦后甜的滋味特征，口味甜[8]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和咖啡堿（CAF）是苦味的主要貢獻者;氨基酸類表現為酸、甜、苦、鮮4種特征，是鮮味和甘味的主要貢獻者[9]，可緩解茶的苦澀味[10]。酶法提取氨基酸含量增加，口感清爽度高、總體可接受程度高。

以茶葉渣為底物提取茶多酚和氨基酸含量均比茶葉低，因熱水沖泡，部分茶多酚和氨基酸溶出，研究表明熱水沖泡后還有37.75%茶多酚、36.18%氨基酸保留在茶葉渣中，采用酶法提取，所得的茶多酚和氨基酸含量比對照（不用酶）分別高15.46%、25.32%，通過酶法可以將殘留在茶葉渣的有效成分提取。與茶葉相比，茶葉渣酶法提取物感官收斂、澀味較濃，但化學成分無明顯區別，茶葉渣可作為原料提取茶多酚，用于食品原料工業。

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（責任編輯 李亞青）