蝦夷扇貝閉殼肌蛋白溶解性與三磷酸腺苷的關聯性

張 晴，姜明慧，田元勇，徐美祿，冷寒冰，劉俊榮

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023 )

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)活品形式經濟價值最高，在離水至消費終端會受到諸多因素影響導致活品品質下降[1-4]。對于活品蝦夷扇貝品質的評價目前主要集中于核苷酸系化合物、代謝酶、蛋白性質及感官等方面。核苷酸系化合物包括K值、三磷酸腺苷、核苷酸能荷值、糖原及pH變化等[5-8]。根據不同的代謝途徑，已經探索出多種可以作為指示鮮品品質的酶，包括章魚堿脫氫酶[9]、精氨酸激酶[10]、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等。也可通過活品肌肉蛋白性質來監測其品質，如肌球蛋白的三磷酸腺苷酶酶活性質，肌球蛋白頭部具有分解三磷酸腺苷的能力，狀態良好時酶活性高，而在活品機體受到脅迫時酶活性就會降低，從而反映出水產品的品質[11]。楊婷婷等[2,12-13]建立了蝦夷扇貝感官評價體系，從風味角度出發，系統地評價了活品蝦夷扇貝的品質，并通過模擬流通鏈的形式研究了在活品流通過程中蝦夷扇貝風味品質的變化。目前，對于食品肌肉質地的評價主要為感官評價，主觀性較強，對于活品蝦夷扇貝的閉殼肌肌肉而言，影響其口感質地的主要因素為肌肉蛋白的收縮作用，因此，可以從肌肉蛋白的角度出發研究肌肉品質。

肌肉蛋白溶解性通常是用來評價魚肉或畜肉在保藏期間肌肉品質變化的重要指標，溶解性與蛋白持水性及肌肉彈性等息息相關。在貯藏過程中，由于肌肉蛋白變性帶來的降解及聚集等會使蛋白溶解性下降，而蛋白溶解性下降也說明肌肉品質受到影響[14-15]。對于活品來說，肌肉收縮程度也會對溶解性造成影響。肌球蛋白為肌原纖維蛋白的主要組成部分，參與調控肌肉收縮，肌球蛋白頭部具有三磷酸腺苷酶活性，尾部為纖維絲狀，尾部凝集會影響溶解性。有研究按照肌肉全蛋白溶解性的差異對豬肉進行了分類，并通過R值(肌苷酸/三磷酸腺苷)的變化比較了不同溶解性肌肉品質差異[16]。筆者主要以軟體動物蝦夷扇貝為研究對象，對不同活力狀態下扇貝閉殼肌蛋白溶解性進行分析，同時對照分析其三磷酸腺苷分布，比較三磷酸腺苷參與下的溶解性變化機制，探究以蛋白質溶解性為切入點的活品貝類評價新思路。

1 材料與方法

1.1 原料貯藏與采樣

干藏：剛采捕上岸的活品蝦夷扇貝運達實驗室后立即進行冷卻干藏，貯藏溫度為4 ℃，分別于0、48、72、96、120 h進行采樣，每次采樣數量為5只，分別對每只扇貝進行三磷酸腺苷及其關聯化合物含量測定，同時對貯藏0、48、120 h的扇貝肌肉蛋白溶解性進行測定。活貝采樣后迅速手工開殼并分離出橫紋肌與平滑肌，操作均在冰浴下完成。

1.2 試驗試劑及儀器

標準牛血清蛋白、考馬斯亮藍R-250(中國北京索萊寶科技有限公司)；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、鹽酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水甲醇、乙酸(中國天津市科密歐化學試劑有限公司)；SDS-聚丙烯酰胺電泳試劑、β-巰基乙醇(美國Sigma公司)；尿素、Tris、高氯酸、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銅(國藥集團化學試劑有限公司)；碘化鉀(上海麥克林生化科技有限公司)；以上化學試劑均為分析純。

GL-21M高速冷凍離心機(德國HERMLE Labortechnik GmbH公司)；AE-6500垂直電泳槽(日本ATTO公司)；UV-1800PC紫外—可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Milli-Q超純水凈化儀(美國Millipore公司)；HG-200高速分散均質機(日本HSIANGTAI)； BS224S型精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；IMS-40全自動雪花制冰機(常熟市雪科公司)。

1.3 肌肉分離及蛋白提取

漂洗碎肉：分離得到橫紋肌與平滑肌碎肉(未漂洗碎肉)。首先用緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)對碎肉進行漂洗，碎肉與緩沖液的比例為1∶10，攪勻后離心(2032 r/min，10 min)得沉淀物，再次加入等量緩沖液攪勻后離心，重復3次對三磷酸腺苷進行洗脫，得到漂洗碎肉及漂洗液。

肌原纖維蛋白提取方法參照文獻[17]并加以改善。取漂洗或未漂洗碎肉，以碎肉與緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)1∶10的比例混合后均質3次(10 000 r/min，30 s)，進行離心處理，并重復3次，取最終沉淀加入適量緩沖液混合均勻，過雙層紗布，即得到肌原纖維蛋白。用雙縮脲比色法對肌原纖維蛋白的質量濃度進行測定，并將蛋白質量濃度調整到10 mg/mL備用。為探究肌肉中三磷酸腺苷存在的影響，分別設置漂洗碎肉組和未漂洗碎肉組。

肌肉蛋白勻漿：分離得到橫紋肌與平滑肌碎肉。碎肉與緩沖液(0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)以1∶10的比例混合，進行3次均質(10 000 r/min，30 s)，即得到肌肉蛋白勻漿。基于雙縮脲比色法分析后將肌肉勻漿的蛋白質量濃度調整到10 mg/mL備用。

EGTA處理：將分離出的橫紋肌與平滑肌碎肉用含有EGTA的緩沖液(5 mmol/L EGTA，0.05 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5)進行肌肉蛋白勻漿的制備。基于雙縮脲比色法分析后將肌肉勻漿的蛋白質量濃度調整到10 mg/mL備用。

1.4 蛋白溶解性測定

雙縮脲比色法：設置9個鹽濃度梯度，濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mol/L，用3 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5緩沖液和去離子水調節鹽濃度，體系中蛋白終質量濃度為5 mg/mL，將反應體系混勻后在冰浴環境下靜置反應20 min，在12 850 r/min條件下離心20 min，用雙縮脲比色法測上清液中的蛋白質量濃度。溶出率為溶出蛋白占總蛋白的百分比。

1.5 三磷酸腺苷測定

固形樣品三磷酸腺苷及其關聯物含量的測定參照文獻[18]的方法，準確稱取1 g肌肉樣品，加入10 mL 5%的高氯酸立即進行組織搗碎10 min，加入2 mol/L KOH調節pH至2.0～3.5，加水補體積至20 mL，離心(2032 r/min，5min)，取4 mL上清液過膜后加入1 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，用反相高效色譜法測定三磷酸腺苷含量。

液體樣品測量時取5 mL樣品，加入10 mL 5%高氯酸，攪拌后用2 mol/L KOH調節pH至2.0～3.5，其余操作與上述固體樣品測定方法一致。

1.6 核苷酸能荷的計算

核苷酸能荷(AEC)按下式計算[19]：

式中，ATP為腺苷三磷酸，ADP為二磷酸腺苷，AMP為磷酸腺苷。

1.7 蛋白質組分分析

根據蛋白分子量的不同，采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白的分布進行分析。其中，分離膠的質量分數為8%，濃縮膠的質量分數為6%，染色液為考馬斯亮藍R-250，采用甲醇—乙酸混合液進行脫色。

2 結果與分析

2.1 干藏期間活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性變化

2.1.1 干藏期間活品活力的變化趨勢

為探究干藏對蝦夷扇貝活力狀態的影響，對活貝閉殼肌的三磷酸腺苷及其關聯物進行跟蹤測定，以三磷酸腺苷含量和核苷酸能荷值為生命活力狀態指標進行分析。在120 h的冷卻干藏期間，活品閉殼肌中三磷酸腺苷含量呈下降趨勢(圖1)。初始原料中三磷酸腺苷含量高達5 μmol/g，隨著干藏時間延長三磷酸腺苷逐漸降解，干藏48 h后三磷酸腺苷含量為3.25 μmol/g，當貯藏時間到達120 h時，三磷酸腺苷幾乎消耗殆盡；核苷酸能荷值由最初的90.64%降至16.02%，分析結果同樣顯示出扇貝活力下降的趨勢。三磷酸腺苷含量和核苷酸能荷值的結果均可以看出蝦夷扇貝經過干藏后生命狀態的減弱。

2.1.2 干藏期間閉殼肌蛋白溶解性變化

干藏期間扇貝肌肉蛋白溶解性變化結果見圖2。經貯藏的扇貝肌肉蛋白溶解性均高于原料，干藏時間越長肌肉蛋白溶解性越高，干藏120 h的蛋白溶解性明顯高于48 h扇貝，與干藏期間肌肉三磷酸腺苷及核苷酸能荷的變化趨勢恰好相反。可見，活品扇貝肌肉溶解性與其三磷酸腺苷的含量呈現負相關。

圖2 干藏時間對活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性的影響

2.1.3 橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷及蛋白溶解性

通過對扇貝原料閉殼肌不同肌肉組織中的三磷酸腺苷含量及相應蛋白溶解性的分析比較，來探究閉殼肌中的三磷酸腺苷是否會對其蛋白溶解性的分析產生干擾。分別對蝦夷扇貝橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷及肌肉蛋白溶解性進行比較，橫紋肌三磷酸腺苷含量明顯高于平滑肌(圖3)；兩種肌肉在蛋白溶解性方面也有明顯差異，平滑肌肌肉蛋白溶解性明顯高于橫紋肌(圖4)。

圖3 活品蝦夷扇貝中橫紋肌與平滑肌的三磷酸腺苷含量

圖4 活品蝦夷扇貝橫紋肌與平滑肌的肌肉蛋白溶解性

2.2 三磷酸腺苷的存在對肌肉蛋白溶出效果的影響

為探究活品蝦夷扇貝閉殼肌中的三磷酸腺苷是否會對其蛋白溶解性的分析產生干擾，進一步通過對三磷酸腺苷進行抑制或排除，探究三磷酸腺苷的存在對肌肉蛋白溶出過程的影響機制。采用Ca2+螯合劑EGTA對三磷酸腺苷酶活性進行抑制，試驗分為添加5 mmol/L EGTA的處理組和未添加EGTA的對照組。結果顯示，EGTA處理組的肌肉蛋白溶解性顯著高于對照組(圖5)。

圖5 EGTA對活品蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性的影響

對閉殼肌碎肉進行漂洗，設置漂洗組和未漂洗組，處理步驟見材料與方法1.3肌肉分離及蛋白提取。每次漂洗后洗脫液中三磷酸腺苷的含量見圖6。結果表明，漂洗處理對碎肉三磷酸腺苷有洗脫作用；首次漂洗的三磷酸腺苷洗脫效果最明顯，漂洗液中三磷酸腺苷含量為0.51 μmol/g，之后的洗脫效果顯著降低，第2、3次漂洗液中三磷酸腺苷含量已經很低，分別為0.05 μmol/g和0.03 μmol/g。值得指出的是，與原料肌肉中5.26 μmol/g(未在圖中顯示)的三磷酸腺苷含量相比，漂洗處理的三磷酸腺苷脫除效果比較有限。

圖6 蝦夷扇貝閉殼肌碎肉漂洗液中三磷酸腺苷含量

分別對漂洗前后的碎肉進行肌原纖維蛋白提取并測定其溶解性，結果見圖7。與未漂洗組相比，漂洗組的肌肉蛋白溶解性有明顯的升高。如前所述，漂洗對三磷酸腺苷有洗脫作用，由此可以判斷，三磷酸腺苷含量越高肌肉蛋白溶解性越低，即三磷酸腺苷的存在對肌肉蛋白溶出有制約作用。

圖7 蝦夷扇貝閉殼肌碎肉漂洗脫除三磷酸腺苷后肌原纖維蛋白溶解性

為進一步探索三磷酸腺苷在肌肉蛋白溶出過程中的作用，對三磷酸腺苷漂洗后的肌原纖維蛋白溶解產物進行組分分析(圖8)。結果表明，在鹽濃度為0.3～0.6 mol/L下三磷酸腺苷漂洗組的肌動蛋白和肌球蛋白顯著高于未漂洗對照組。

圖8 碎肉漂洗脫除三磷酸腺苷后蝦夷扇貝閉殼肌肌原纖維蛋白溶出變化

2.3 肌肉均質過程中的三磷酸腺苷降解

肌肉蛋白提取過程中三磷酸腺苷降解對蛋白溶解效果有影響，因此，需要進一步探跟蹤分析肌肉細胞破碎前后三磷酸腺苷含量的變化。分別對活貝肌肉及其通過未漂洗組操作后的均質肌肉勻漿中三磷酸腺苷含量進行檢測。活貝肌肉中三磷酸腺苷的含量高達4.0 μmol/g，在進行均質處理(10 000 r/min，30 s)3次后三磷酸腺苷全部降解，大量的二磷酸腺苷生成(圖9)。此結果證實了三磷酸腺苷對肌肉溶解性的影響主要發生在溶出過程，即細胞破碎處理的均質階段，原因是高含量的三磷酸腺苷在均質過程全部降解，所釋放的能量使肌肉粗絲與細絲收縮，肌球蛋白與肌動蛋白發生收縮凝集導致溶解性降低。因此，在活品蝦夷扇貝肌肉中三磷酸腺苷的存在會對溶解性的測定造成影響。

圖9 蝦夷扇貝閉殼肌均質過程三磷酸腺苷含量的變化

3 討 論

3.1 三磷酸腺苷與活品扇貝肌肉蛋白溶解性的關聯

肌肉蛋白溶解性與肌肉品質特別是咀嚼感密切相關，往往用做魚品品質評價指標。李強[20]在對草魚(Ctenopharyngodonidellus)冷藏過程中肌肉蛋白性質變化的研究中發現，草魚肌動球蛋白溶解性呈下降趨勢，隨著貯藏時間延長，下降趨勢逐漸減緩，而肌動球蛋白鹽溶解性的下降可能是凍藏過程中草魚肌肉蛋白質變性引起的，尤其是肌球蛋白的降解。李娜等[21]在對冰藏過程尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)魚片肌肉蛋白質變化的研究中推測，肌原纖維蛋白含量下降可能由于尼羅羅非魚冷藏期間肌肉組織中內源性蛋白酶持續作用于蛋白質，同時微生物的生長和繁殖產生大量外源性蛋白酶，共同作用使蛋白質降解。因此，對于凍藏魚類來說，肌肉蛋白變性帶來的降解、聚集等原因使蛋白溶解性發生變化，使魚肉品質受到破壞。活品貝類貯藏中溶解性變化與冷凍魚類有明顯的差異。對于活體貝類來說，三磷酸腺苷為生命機體主要能量代謝物質，并且與肌肉收縮密切相關[22]，而肌肉蛋白溶解性也與肌肉收縮密不可分。在本試驗中，隨著蝦夷扇貝生命活力的下降，三磷酸腺苷的含量明顯降低，但是溶解性顯著升高。說明三磷酸腺苷與溶解性之間可能存在負相關性。貝類的閉殼肌由橫紋肌和平滑肌構成，橫紋肌占閉殼肌的大部分，平滑肌僅占閉殼肌的一小部分，兩種類型的肌肉在肌肉組織形態、蛋白組成、溶解性等方面均存在差異[23]，并且兩種類型的肌肉主導著貝類不同的收縮狀態。在針對閉殼肌兩種肌肉類型肌肉即橫紋肌與平滑肌的研究時，發現三磷酸腺苷含量較高的橫紋肌，其蛋白溶解性明顯低于三磷酸腺苷含量較低的平滑肌，這也說明對于活品貝類而言，三磷酸腺苷與肌肉蛋白溶解性有著密不可分的關聯。

3.2 三磷酸腺苷對活品扇貝肌肉蛋白溶解性干擾作用

采用EGTA對Ca2+進行螯合處理，進而抑制三磷酸腺苷酶活性使三磷酸腺苷失去調節作用后再對肌肉蛋白溶解性進行分析比較。三磷酸腺苷在活品蝦夷扇貝閉殼肌肌肉收縮過程中起重要的調節作用，這種調節與兩種收縮蛋白肌球蛋白和肌動蛋白有關。肌球蛋白頭部具有三磷酸腺苷酶活性，在Ca2+存在下可以分解三磷酸腺苷產生能量，從而促進肌絲滑動引起肌肉收縮[22,24-25]。本研究中，EGTA的加入抑制了三磷酸腺苷酶活性，有效阻擋了三磷酸腺苷降解，由此判斷肌肉蛋白溶解性與肌肉中的三磷酸腺苷有密切關聯。而通過漂洗肌肉對三磷酸腺苷進行洗脫后也導致其溶解性的升高，進一步證實了蝦夷扇貝肌肉蛋白溶解性與三磷酸腺苷之間的關聯。肌動蛋白和肌球蛋白與肌肉收縮密切相關，活體肌肉收縮依賴三磷酸腺苷降解所提供的能量；三磷酸腺苷是調節肌肉收縮的重要能量物質，當三磷酸腺苷消耗殆盡時肌原纖維蛋白粗絲與細絲便會無法進行收縮而使肌絲緊密結合[26,27]。閉殼肌肌原纖維蛋白中的肌球蛋白與肌動蛋白在三磷酸腺苷存在下，發生類似活體收縮的肌動球蛋白形成，即超沉淀現象[28]，導致溶解性下降，三磷酸腺苷漂洗組與未漂洗組的溶解性差異說明了三磷酸腺苷的存在對肌肉蛋白溶出的干擾效應。

4 結 論

活力狀態好的活品蝦夷扇貝閉殼肌富含三磷酸腺苷，且橫紋肌三磷酸腺苷含量高于平滑肌。冷卻干藏期間三磷酸腺苷呈下降趨勢，5 d內三磷酸腺苷耗盡，同時伴隨著肌肉蛋白質溶解性上升。漂洗閉殼肌碎肉有三磷酸腺苷洗脫效果，肌肉細胞破碎過程會引起三磷酸腺苷降解。無論是抑制三磷酸腺苷酶活性還是對三磷酸腺苷進行洗脫，均會提高肌肉蛋白溶解性。三磷酸腺苷對肌肉蛋白溶出效果的影響機制發生在肌肉細胞破碎過程中，三磷酸腺苷降解引起肌球蛋白與肌動蛋白發生凝集收縮導致蛋白溶解性下降。對于捕后早期富含三磷酸腺苷的活品蝦夷扇貝，肌肉蛋白溶解性是否能夠作為其品質評價指標，還需進一步對三磷酸腺苷及溶解性的關聯進行系統探明。