麥蚜及植物病毒脅迫下小麥體內保護酶和解毒酶活性的變化

張 弛，孟琳欽，蘇 丹，仝則乾，胡祖慶

(旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，西北農林科技大學植物保護學院，陜西楊凌712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是中國主要糧食作物之一，其產量和品質直接影響國家糧食生產安全。小麥生長過程中常受到病毒病和麥蚜的危害。大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus，BYDV)在中國主要有4種株系，即GAV、PAV、RMV和GPV，其中GAV株系是引起中國小麥黃矮病的主流株系，可造成小麥植株矮化、葉片倒V字黃化，小麥黃枯后，受害植株下部葉片仍呈綠色[1]，是目前中國北方麥區的主要病毒病。麥蚜，屬半翅目蚜科(Hemiptera:Aphididae)，以刺吸小麥汁液，影響光合作用，還可傳播小麥病毒病，間接影響小麥生產[2]。中國常見的麥蚜有麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)、禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi)和麥長管蚜(Sitobionavenae)，麥二叉蚜和麥長管蚜是大麥黃矮病毒BYDV-GAV株系的傳毒介體[3]。在田間，BYDV-GAV和3種蚜蟲往往同時發生，因此亟需研究BYDV-麥蚜-小麥三者的互作關系，為指導小麥生產中蚜蟲和BYDV-GAV的綜合治理提供幫助。

植物的生長發育常受多種生物的侵擾脅迫，植物病毒和介體昆蟲是其中影響較大的兩類。寄主植物受病毒侵染后，其正常生理代謝進程被干擾，表現為植物生長受阻，產量和品質降低，因此植物病毒病又被稱為“植物癌癥”[4]。植物病毒與寄主植物之間存在明顯的相互作用，植物病毒侵染植物后，可導致寄主植物的形態特征發生改變，主要表現為葉片變異、組織壞死和畸形[5]；體內的揮發性物質(volatile organnic compound，VOC)的種類與含量也會發生改變[6-7]；此外，寄主植物感染病毒后，體內的氨基酸、碳水化合物等營養成分也會受到影響[8]。媒介昆蟲取食能影響寄主植物的生理狀態，如應對刺吸式昆蟲取食，植物具有閉塞篩管的功能[9]，此外寄主植物還能提高防御信號物質(如水楊酸、茉莉酸、活性氧等)的含量并激活相應防御途徑以抵御昆蟲的脅迫[10-11]。與病毒脅迫相似，受媒介昆蟲危害后，寄主植物也會調節體內防御性次級代謝產物的生成和釋放[12]。寄主植物在長期的進化過程中，形成和構建了應對多種脅迫的防御系統和反應機制，其中，活性氧在寄主植物應對外源病毒侵染和植食性昆蟲取食過程中發揮了重要作用[13]。細胞外，活性氧具有直接殺死病菌的功能，而在細胞內則通過發揮信號傳遞功能來啟動植物體內防衛基因的表達，活性氧過多時，植物的細胞結構會受到不可逆的損傷，最終死亡。植物體內存在超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等活性氧清除酶系[14]，可避免過多的活性氧對植物造成損害；植物體內還存在酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(AKP)等解毒酶以應對病毒和媒介昆蟲的脅迫。ACP具有誘導活性，其活性受植物供磷狀況的影響，通過將環境中的有機磷降解為植物體可吸收的磷酸鹽和焦磷酸來供給植物營養[15]。目前，病毒和媒介昆蟲對植物的影響主要集中在植物受脅迫后體內揮發物和營養成分的變化等方面，而對植物體內保護酶系和解毒酶系活性的影響尚不明確。鑒于此，本研究以麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜為試蟲，以BYDV-GAV為測試病毒，分析蚜蟲、植物病毒及兩者共同脅迫下小麥體內保護酶系和解毒酶系的活性變化規律，以期為探究蚜蟲-病毒-小麥三者間的互作關系奠定基礎，為蚜蟲和BYDV-GAV的綜合治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試小麥

供試小麥品種為矮抗58，來自陜西省作物雜種優勢研究與利用重點實驗室。采用盆栽試驗，試驗用盆為PVC塑料盆，直徑9 cm，高8 cm。播種前用清水將小麥種子浸泡24 h，隨后將4～5粒種子撒入裝有2/3體積育苗基質的PVC塑料盆中，最后再覆蓋1/3體積的育苗基質。用噴壺噴水至浸透育苗基質，播種后，用透明塑料籠罩(頂端帶有紗網)罩住塑料盆，放入人工氣候箱(溫度25 ℃，相對濕度60%，光周期14L∶10D)培育，待小麥長至一心一葉期時備用。

1.1.2 供試毒源

在西北農林科技大學北校區試驗農場麥田(34°17'18.8"N，108°04'06.0"E)顯癥的小麥植株上采集麥二叉蚜，通過RT-PCR方法進行BYDV株系鑒定，BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 3種株系的鑒定引物設計均參考劉雙清[16]的方法，確認麥二叉蚜體內僅含有GAV株系后，放入人工氣候箱內單頭長期飼養。蚜蟲和植物每隔2～3代后，均進行BYDV-GAV、BYDV-PAV和BYDV-GPV 株系的檢測，以確保存在僅感染大麥黃矮病毒GAV株系。

1.1.3 供試蟲源

采集地點同1.1.2。單頭采集麥二叉蚜、禾谷縊管蚜和麥長管蚜，每采集點相隔至少5 m，采集后在人工氣候箱內單頭飼養10代以上形成單克隆系，進行RT-PCR鑒定(鑒定方法同1.1.2)，確保其體內不含BYDV任何株系后備用。

1.1.4 主要儀器和試劑

Infinite M200全波長酶標儀，瑞士Tecan公司；BIC-300人工氣候箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。POD過氧化物酶試劑盒、CAT過氧化氫酶試劑盒、SOD超氧化物歧化酶試劑盒、ACP酸性磷酸酶測試盒和AKP堿性磷酸酶測試盒，均生產自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

(1)麥蚜影響小麥酶活性試驗。小麥長至一心一葉期后，每盆保留3株小麥，接入30頭(每株10頭)24 h內初生的無毒麥二叉蚜/禾谷縊管蚜/麥長管蚜作為麥二叉蚜處理組(Sg1)/禾谷縊管蚜處理組(Ra1)/麥長管蚜處理組(Sa1)，不接種蚜蟲的健康小麥作為對照組(CK1)。待長至成蚜后，剔除所接蚜蟲，分別收集花盆中的3株小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，將采集的葉片進行下一步的酶活測定。每個處理重復3次。

(2)BYDV影響小麥酶活性的試驗。小麥長至一心一葉期后，每盆保留3株小麥，處理組(BYDV)每盆接入15頭(每株5頭)攜帶BYDV-GAV株系麥二叉蚜3齡若蚜，對照組(CK2)接入無毒麥二叉蚜3齡若蚜。處理72 h后，剔除所接蚜蟲，并分別收集花盆中的3株小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，通過RT-PCR鑒定確認處理組3株小麥均含有BYDV-GAV病毒后，將采集的葉片進行下一步的酶活測定。每個處理重復3次。

(3)蚜蟲與BYDV病毒共同影響小麥酶活性的試驗。通過接種攜帶BYDV-GAV株系麥二叉蚜3齡若蚜的方法獲得帶毒小麥，每盆保留3株小麥，每盆接入30頭(每株10頭)24 h內初生的無毒麥二叉蚜/禾谷縊管蚜/麥長管蚜若蚜作為麥二叉蚜處理組(Sg2)/禾谷縊管蚜處理組(Rp2)/麥長管蚜處理組(Sa2)，選擇感染植物病毒但未受蚜蟲脅迫的小麥作為空白對照組(CK3)，待30頭若蚜均長至成蚜后剔除，分別收集小麥，每株剪葉片2～3段，每段3～4 cm，通過RT-PCR鑒定，確認處理組3株小麥均含有BYDV-GAV病毒后，將采集的葉片進行下一步的酶活測定。每個處理重復3次。

1.2.2 酶活測定方法

取經過處理的新鮮葉片0.2 g與無菌0.9%生理鹽水(測SOD活性需加等量的PBS緩沖液)按質量∶體積=1∶9的比例混合并加入少量石英砂，在冰上迅速將葉片研磨成勻漿液，轉入離心管4 ℃ 2 500 r·min-1離心10 min，上清液即為酶原液。所有酶活性均按照南京建成酶活試劑盒的方法進行測定。

1.3 數據處理

用Microsoft Excel軟件分析整理數據，計算酶活性；用SPSS 20.0 軟件對酶活數據進行單因素方差分析，Tukey法(P=0.05)進行多重比較，數據用“平均數±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 3種麥蚜對小麥體內主要保護酶和解毒酶活性的影響

由表1可知，與不接種蚜蟲的健康小麥(CK1)相比，麥二叉蚜處理組(Sg1)小麥體內的POD活性無顯著差異，禾谷縊管蚜處理組(Rp1)小麥體內的POD活性顯著下降，降幅為 34.59%，麥長管蚜處理組(Sa1)則顯著上升，增幅為83.88%；Sg1和Rp1小麥體內CAT、SOD和AKP活性均與CK1無顯著差異，而Sa1小麥體內CAT、SOD和AKP活性則均顯著上升，增幅分別為91.21%、126.45%和468.82%；Sg1和Sa1小麥體內ACP活性均顯著高于CK1，增幅分別為100.46%和197.26%，而Rp1則無顯著差異。

表1 不同麥蚜處理組健康小麥體內保護酶和解毒酶的活性

2.2 BYDV對小麥體內主要保護酶和解毒酶活性的影響

由表2可知，與未感染植物病毒的小麥(CK2)相比，感染BYDV-GAV病毒(BYDV)的小麥體內，POD、CAT、ACP和AKP活性均無顯著差異，SOD酶活性則顯著上升，增幅達 37.41%。說明BYDV病毒對小麥體內POD、CAT、ACP和AKP活性無明顯影響，但能導致小麥體內SOD活性顯著增加。

表2 感染與未感染病毒處理組小麥體內保護酶和解毒酶的活性

2.3 麥蚜對感染BYDV-GAV小麥體內主要保護酶和解毒酶活性的影響

由表3可知，與感染植物病毒但未受蚜蟲脅迫的小麥(CK3)相比，麥二叉蚜處理組(Sg2)、麥長管蚜處理組(Sa2)和禾谷縊管蚜處理組(Rp2)小麥體內的CAT活性均顯著上升，增幅分別達110.72%、115.13%和70.19%；Sg2、Rp2和Sa2的SOD活性均與CK3無顯著差異；Sg2和Sa2小麥體內POD活性顯著高于CK3，增幅分別達73.66%和97.58%，Rp2與CK3則無顯著差異；Sg2和Rp2小麥體內ACP活性顯著高于CK3，增幅分別為50.49%和37.00%，Sa2與CK3則無顯著差異；Sa2小麥體內AKP活性顯著高于CK3，增幅達3 665.03%，Sg2和Rp2與CK3則無顯著差異。

表3 不同麥蚜處理下感染BYDV小麥體內保護酶和解毒酶的活性

3 討 論

植物為應對植食性昆蟲的脅迫，體內會產生活性氧(ROS)作為信號轉導物質，誘導植物產生次生代謝物質，而SOD、CAT和POD組成的保護酶系可以清除過多的ROS，保護植物細胞膜的結構[17-19]，因而保護酶系的活性變化可作為觀察指標，以確認植物是否對外界脅迫產生了誘導防御反應，從而判斷植物對某種昆蟲的抗性強弱以及昆蟲對寄主植物的適合度[20-21]。

吳龍火等[17]和茍長青等[21]分別研究了害蟲脅迫下植物山羊草和苜蓿體內的保護酶系變化規律，均發現植物對不同種類害蟲的防御反應具有差異性，本研究表明，小麥對麥長管蚜的防御反應強度高于麥二叉蚜和禾谷縊管蚜，也得到了類似的結論。本研究也從側面印證了實際觀察中發現的麥長管蚜在小麥苗期時比禾谷縊管蚜和麥二叉蚜的適合度低這一現象，其具體機制則需進一步研究確定。與未感染病毒的植物相比，BYDV-GAV脅迫下，小麥體內SOD活性顯著升高，可能是因為病毒侵染使小麥體內超氧自由基含量上升，過量的超氧自由基則刺激SOD酶活性提高以抑制細胞膜質過氧化作用，這與玉米對矮花葉病毒[14]及棉花對紅腐病菌[22]的防御反應表現一致。

在田間，植物病毒與害蟲往往同時發生，兩者的互作關系會對小麥體內的生化防御產生影響，到目前為止此類研究還未見有報道。本研究分析了BYDV-GAV存在條件下麥蚜對小麥體內保護酶活性的影響，結果表明，與感染BYDV-GAV但未受蚜蟲脅迫的小麥相比，麥二叉蚜與麥長管蚜脅迫下小麥體內的POD、CAT活性均顯著升高，禾谷縊管蚜脅迫下僅有CAT活性顯著上升，推測這可能是因為在病毒存在條件下，麥蚜的取食危害使得小麥體內的H2O2含量急劇升高，小麥需要提高POD和CAT活性或者合成更多的酶來降解，而H2O2升高的原因與SOD催化超氧自由基產生H2O2與O2是否有關則需進一步的研究驗證。

磷酸酶是一種能將有機磷分解為植物體直接吸收的無機磷的水解酶，ACP與AKP的區別在于：ACP需在酸性條件下參與催化反應，而AKP則具有非特異性[23-24]，植物體內二者活性受到植物供磷狀況的影響，可作為植物面對磷脅迫的變化指標，以判斷植物對磷的利用情況[25-26]。本研究表明，麥長管蚜和麥二叉蚜取食使小麥出現低磷脅迫，需提高磷酸酶的活性以應對低磷脅迫，而禾谷縊管蚜取食、BYDV-GAV侵染不會對小麥造成磷脅迫。但在BYDV-GAV存在條件下，麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜均能使小麥出現低磷脅迫，這可能是因為禾谷縊管蚜與BYDV-GAV聯合脅迫對小麥產生了不良影響，使其出現低磷脅迫。

在農田生態系統長期進化過程中，大麥黃矮病毒(BYDV)-介體麥蚜-小麥三者間形成了復雜的互作關系。本研究僅在室內控制條件下分析了BYDV和麥蚜脅迫下小麥體內的保護酶和解毒酶活性，其變化規律還有待在農田生態系統中進行進一步驗證。此外，有必要在此研究基礎上進一步利用轉錄組學的方法研究小麥體內保護酶和解毒酶的基因表達量，為明確小麥抗性生化機理和防御反應機制奠定基礎，從而了解小麥應對不良環境脅迫時的基因適應機制。