南京地區斑點叉尾鮰養殖池塘水體微生物群落結構研究

鐘立強，王明華，張世勇，姜虎成，陳校輝，朱廣偉，邊文冀*

（1.江蘇省淡水水產研究所，南京210017；2.中國科學院南京地理與湖泊研究所 湖泊與環境國家重點實驗室 太湖湖泊生態系統研究站，南京210008；3.中國科學院大學，北京100049）

中國是全球最大的漁業養殖和水產品消費國家，水產養殖產量占世界水產養殖總產量的60%以上[1]。而內陸淡水池塘養殖又是其中最主要的養殖方式，2018 年養殖面積達252.7 萬hm2，養殖產量2 212.2 萬t，占全國水產品總產量的32.9%[2]。池塘養殖時，強調“養魚先養水”，即魚苗在下塘養殖前，要提前對養殖池塘的水體進行施肥等管理工作，使得養殖水體保持“肥、活、嫩、爽”。從生態學角度講，這個過程就是通過施肥加速養殖水體富營養化，促進藻類及浮游動物的生長，從而提高水體生產力，為魚類提供充足的生物餌料，形成相對穩定并適合魚類生活的微生態環境。

與自然水域生態系統不同，淡水池塘養殖是特殊的人為操縱生態系統。充足的營養鹽通過上行效應提高魚類產量的同時，大量投入的有機質也為池塘生態系統食物網的腐屑鏈提供了能量和物質基礎。細菌在腐屑鏈中占據著重要地位，一方面細菌起著降解作用，是物質和能量的貯存者，另一方面，它們是重要的生產者，能夠將有機質轉化為細菌菌體蛋白，直接被浮游動物和魚類攝食[3]。已有研究表明，細菌群落與水體的營養水平及浮游植物的生物量存在明顯關系[4-5]。養殖池塘中，由于富營養化和魚類的牧食壓力，小型浮游植物和浮游動物占據優勢[6]，進而可能對池塘生態系統中的細菌群落結構造成影響。因此，對養殖池塘水體細菌群落結構開展研究十分必要。本文采用16S rRNA 基因片段高通量測序技術對南京斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）淡水養殖池塘水體細菌群落的周年變化開展了研究，目的主要是：（1）了解斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落組成、多樣性的年度變化特點；（2）明確斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落結構的主要影響因子。這些研究結果將對斑點叉尾鮰養殖池塘水體的精細化管理和健康養殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 養殖池塘及樣品采集

試驗在江蘇省淡水水產研究所國家斑點叉尾鮰遺傳育種中心養殖基地開展。養殖池塘面積0.21 hm2（50 m×42 m），位于南京市江寧區祿口鎮（31°77′03″N，118°88′29″E）。養殖開始前一個月抽干池水，漂白粉清塘后，加水至1.5 m左右，池塘中央設置一臺增氧機。4—10 月，每晚23：00 開啟增氧機至次日凌晨4：00，晴天中午11：00 點開啟2 h，保證養殖水體溶氧充足。夏季每月月中補水，春秋季則每2 月補水一次。池塘內放入2 747 尾斑點叉尾鮰魚種（平均18.91 g·尾-1），養殖從11月底至次年12月初。每日早晚兩次投喂漂浮性顆粒配合飼料（蛋白含量35%），飼料投喂量為魚體質量的3%左右。

養殖周期內，每月的月末開展水樣采集。每次上午10：00，利用Schindler 采水器（5 L）采集3處池塘表層50 cm 的水樣，放入滅菌塑料瓶。水樣放入4 ℃保溫箱帶回實驗室，分析時樣品為3 個點水樣的混合樣。取300 mL 混合水樣經0.22 μm 的聚碳酸酯膜（Millipore，Cork，Ireland）負壓過濾，得到濾膜樣品，放入2 mL 的無菌離心管，-80 ℃超低溫冰箱冷凍保存，留待DNA 提取。另取200 mL 混合水樣4 ℃低溫保存，進行水質的化學因子分析。

1.2 池塘水質因子測定

利用多功能水質參數儀（YSI6920v2，USA）現場測定溫度（Temp）、酸堿度（pH）、總溶解性懸浮物（TDS）、濁度（Tur）以及溶解氧（DO）等環境因子。塞氏盤測定水體透明度（SD）。其他水質指標在實驗室內按以下方法測定：總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894—1989）；銨態氮（NH-N）采用納氏試劑分光光度法（GB 7479—1987）；硝態氮（NO-N）采用酚二磺酸分光光度法（GB 7480—1987）；亞硝態氮（NO-N）采用分光光度法（GB 7493—1987）；總磷（TP）和正磷酸鹽（PO-P）采用磷鉬藍比色法（HJ 670-2013）；總有機碳（TOC）采用燃燒-非分散紅外吸收法（GB 13193—1991）；化學需氧量（CODMn）采用高錳酸鉀滴定法（GB 11892—1989）。水樣經Whatman GF/C 0.45μm濾膜過濾后，分光光度法（HJ 897—2017）測定葉綠素a（Chl a）含量。

1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴增

水樣過濾收集濾膜，用預先經75%酒精擦拭過的醫用剪刀剪碎后，利用Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒（Qiagen，CA，USA）提取微生物總DNA。提取的DNA 經紫外分光光度計和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度及純度后，-20 ℃保存備用。以通用引物338F 和806R 擴增16S rRNA 基因V3-V4 高變區[7]，建庫及高通量測序在上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 數據優化與分析

生物信息學分析前，先用Trimmomatic軟件[8]去除測序原始序列的引物和barcode 標簽，再用FLASH 軟件[9]對序列進行拼接，使用VSEARCH（1.9.6）將序列以97%相似性聚類成操作分類單元（Operational taxonomic units，OTUs），比對的參考數據庫是Silva_132 16SrRNA database（http：//www.arb-sliva.de）[10]。

所有統計分析及可視化分析均利用R 語言中的vegan和ggplot2程序包（Version 3.2.2）以及上海美吉生物醫藥科技有限公司I-sanger 云平臺完成。多樣性分析前，根據每個樣本中最少的序列數進行抽平。利用mothur 軟件計算α 多樣性[11]。計算β 多樣性前，對抽平后的物種數據進行Hellinger 轉化[12]，再進行非度量多維尺度分析（Nonmetric multi-dimensional scaling，NMDS）[13]。對環境因子進行999次Monte Carlo置換檢驗的前向選擇后，采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）對環境因子與微生物群落進行典范對應分析[14]。采用相似性分析（Analysis of similarities，ANOSIM）檢驗季節間差異。最后，通過多物種線性差異判別分析（Linear discriminant analysis effect size，LEfSe），根據分類學組成對樣本按照不同分組條件進行線性判別分析（LDA），找出具有季節顯著性差異的菌群[15]。

2 結果與分析

2.1 水體理化特征

年度養殖試驗過程中，水溫（Temperature）呈現出明顯的季節性變化，從冬季的1月末逐步升高，夏季7月末達到峰值33.78 ℃，之后緩慢下降，除春季和秋季外，其他季節間水溫都存在顯著性差異（P＜0.05）?？側芙庑詰腋∥铮═DS）和水體透明度（SD）都呈現出持續下降的趨勢，且都是冬春季顯著高于夏秋季（P＜0.05）。全年水樣pH 介于7.68～9.50，始終保持偏堿性，冬季水體的堿性顯著強于夏季（P＜0.05）。水體溶氧（DO）含量為6.12～16.39 mg·L-1，適合魚類養殖，冬季水體的溶氧含量也顯著高于其他3 個季節（P＜0.05）。水體總氮（TN）和總磷（TP）濃度始終維持較高水平，一直處于富營養化狀態，四季間TN 變化不大，但冬季TP 濃度顯著低于夏秋季節（P＜0.05）。氨氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽（NO-2-N）、硝酸鹽（NO-3-N）隨季節的變化表現出一定的差異，但正磷酸鹽（PO3-4-P）則全年無顯著性變化?？傆袡C碳（TOC）也表現為冬春季顯著高于夏秋季（P＜0.05）。葉綠素a（Chl a）夏秋季要高于冬春季，其中夏季顯著高于其他3 個季節，并在7 月達到年度峰值，冬季的葉綠素a 濃度最低。水體理化特征見表1。

表1 斑點叉尾鮰養殖池塘水體理化性質Table 1 Summary of physicochemical parameters for water samples of channel catfish pond

2.2 微生物群落多樣性特征

經優化處理后，共獲得356 877條序列，平均每個樣品有29 741 條高質量序列，序列平均長度為434.55 bp。這些序列被聚類為1 023 個OTUs。稀釋曲線分析中所有樣本的都接近平緩，表明本次試驗抽樣充分，測序深度足以反映每個樣本細菌群落的生物信息。

選取Ace指數、Chao1指數、Shannon指數和Simp-son指數用來反映養殖池塘水體細菌群落的物種豐富度和多樣性。結果顯示（圖1），養殖年度內，Ace 指數和Chao1指數變化趨勢較為一致：冬春季呈S形變化，最小值出現在冬季2 月，并與相鄰的1 月以及初春的3 月形成細菌群落物種豐富度的小低谷，之后的3 個月又持續上升；7 月Ace 指數和Chao1 指數大幅下降，之后鋸齒狀震蕩上升，并在10 月達到年度最大值。使用單因素方差分析（ANOVA）對4 個季度的Ace 指數和Chao1 指數進行多重比較，結果表明，兩個指數只有秋季和冬季之間存在顯著性差異（P＜0.05）。年度內養殖池塘水體細菌群落的Shannon 指數和Simpson指數變化趨勢呈相反的趨勢，表明細菌群落多樣性變化相對穩定，預測結果較為一致。Shannon 指數和Simpson指數為對應的“山”字狀，7月是細菌群落多樣性的最低值，且與其他月份差別較大，3月則是倒數第二低值，其他月份變化都不大（圖1）。單因素方差分析與多重比較（ANOVA）結果顯示，4 個季度Shannon指數和Simpson指數間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 斑點叉尾鮰養殖池塘水體微生物群落α多樣性Figure 1 The alpha diversity of bacterial community in channel catfish pond

使用非度量多維尺度分析（NMDS）展示養殖池塘水樣細菌群落的β 多樣性。NMDS 分布圖（圖2A）顯示，所有樣本呈現出較好的季節性排列趨勢，即4個季度的樣本可以被明顯地區分，同一季度內的樣品間距離更近，其微生物群落也更加相似。同時，整個年度水體細菌群落也呈現出連續的演替特征，從排序圖的左側連續往右排列，只有夏季樣品的群落稍有例外，與秋季略有重疊，但整體排在右側。NMDS 分析的Stress值為0.042，也表明排序結果可靠。細菌群落層次聚類分析的結果與NMDS類似，所有群落聚為兩簇（圖2B）：夏季和秋季樣品（11 月樣品除外）聚為一簇，冬季和春季的樣品聚為另一簇。各分簇內部，每個季節的樣品也聚類為一支。

2.3 微生物群落結構

1 023 個OUT 被注釋為27 個門（Phyla）、60 個綱（Classes）和347個屬（Genera）。為了減少群落的復雜性和冗余性，相對豐度低于1%的群落都歸為稀有種，并為“Others”[16]。

養殖池塘水體樣本中OTU 數量從高到低呈現為秋季＞春季＞夏季＞冬季。4個季節樣本共享的OUT有324個，占全部OTU 的31.67%，3個季節和2個季節樣品間共享OUT分別為274個和267個，占比26.78%和26.09%。而單季樣品獨有的OUT 數量最少，只有158個，占比15.44%。其中，冬季和秋季樣品獨有OUT 最多，分別為48個和47個，占比4.69%和4.59%，夏季樣品獨有OUT最少，僅29個，占比2.83%。

圖2 斑點叉尾鮰養殖池塘水體微生物群落NMDS排序圖和層級聚類分析Figure 2 NMDS plot and hierarchical clustering analysis of the compositional dissimilarities of the bacterial communities

ANOSIM 檢驗表明4個季度養殖池塘水體樣品間細菌群落組成存在顯著性差異（P＜0.01）。然而，分析細菌群落結構組成，所有樣品在門水平上組成較為相似。相對豐度從高到低依次為：藍藻門Cyanobacteria（29%）、放線菌門Actinobacteria（25%）、變形菌門Proteobacteria（20%）和 擬 桿 菌 門 Bacteroidetes（12%），這4 個門占全部群落的86%。而疣微菌門Verrucomicrobia（3.9%）、浮 霉 菌 門Planctomycetes（3.2%）、厚壁菌門Firmicutes（2.5%）、綠菌門Chlorobi（1.8%）和綠彎菌門Chloroflexi（1.4%）相對豐度都低于4%。

門水平上，冬季水體樣品中放線菌門相對豐度最高，之后依次為變形菌門、藍藻門以及擬桿菌門。而春、夏、秋3 季的水體樣品中藍藻門相對豐度最高，之后分別為放線菌門、變形菌門和擬桿菌門。各個季度樣品內其他菌門的相對豐度都低于5%。從時間角度上看，養殖池塘水體中4 個主要菌門的相對豐度呈現出截然不同的變化趨勢（圖3）。藍藻門的相對豐度呈單峰形變化，夏季達到最高峰（37%），春秋季略有下降（30%和32%），冬季最低（17.45%）。其中，3 月和7 月水體中藍藻門相對豐度出現了兩次明顯的升高，分別為49.97%和56.77%。放線菌門相對含量則表現為增長的趨勢，從春季的20%一直增加至冬季的29%。變形菌門1 年內的相對豐度保持相對穩定，維持在20%左右。擬桿菌門則呈U字形變化，即冬春季高（15%左右），夏秋季低（8.5%）。

4 個季度樣品間的細菌群落結構比較顯示，厚壁菌門、綠菌門和Saccharibacteria門存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，冬春季的厚壁菌門相對數量顯著高于夏秋季，綠菌門相對數量則是夏秋季顯著高于冬春季，而秋季Saccharibacteria 門的相對數量顯著高于其他3個季節。

圖3 斑點叉尾鮰養殖池塘水體微生門級水平細菌群落結構的年度變動Figure 3 Annual dynamic of bacterial community composition at the phylum level

屬水平上，養殖池塘水體的優勢菌屬為hgcI_clade、藍細菌屬norank_c__Cyanobacteria、聚球藻屬Syn?echococcus、CL500-29、CL500-3和多核桿菌屬Polynu?cleobacterium。聚類熱圖表明，屬水平上，所有樣品聚為冬春和夏秋兩簇（圖4）。其中，腸球菌屬Enterococ?cus、芽孢桿菌屬Bacillus、乳球菌屬Lactococcus、單胞菌屬Polaromonas、紅育菌屬Rhodoferax和黃桿菌屬Flavobacterium的相對豐度在冬春季明顯高于夏秋季。而甲基嗜酸菌屬Candidatus_Methylacidiphilum、球衣菌屬Sphaerotilus、玫瑰單胞菌屬Roseomonas、不動桿菌屬Acidibacter和湖沉積桿菌屬Limnobacter的相對豐度則是夏秋季明顯高于冬春季。

2.4 季節差異性菌群分析

圖4 養殖池塘水體微生物屬級水平的分層聚類熱圖Figure 4 Bacterial community heatmap analysis in genus level

4個季度樣品間的細菌群落結構比較在3個菌門發現了顯著性差異，在時間維度上進一步采用LefSe軟件對養殖水體細菌群落樣本進行線性判別分析（LDA），以找到各個季節顯著性對應的群落或物種。對LDA 判別值大于3.5 的細菌類群進行分析，共有不同分類水平的53個細菌類群，在4個季節間具有顯著差異（圖5）。春、夏和秋3 個季節的顯著優勢種相對集中，主要分布于一兩個門。其中，春季的水體中，優勢性菌群主要集中于厚壁菌門中的腸球菌屬Entero?coccus，以及藍藻門中的SubsectionIV。夏季水樣中，優勢性菌群集中于變形菌門中的δ-變形菌綱Deltaproteobacteria，寡彎菌屬Oligoflexaceae，以及變形菌門中的球衣菌屬Sphaerotilus和藍藻門中的顫藻屬Oscillatoria。秋季的樣品優勢菌群則主要集中于綠菌門中的OPB56 屬、Saccharibacteria 門，以 及 藍 藻 門 中 的 屬FamilyI和變形菌門中的紅螺菌目Rhodospirillales 與玫瑰單胞菌屬Roseomonas。冬季具有顯著優勢菌群最多，共有2 個綱、6 個目、9 個科和10 個屬。其中，疣微菌門中的疣微菌綱Verrucomicrobiae 疣微菌科Verrucomicrobiaceae、豐佑菌綱OpitutaeVadin中的HA64屬、放線菌門中的PeM15 綱、從棒狀桿菌綱Corynebacteriales中的分枝桿菌屬Mycobaterium、厚壁菌門中的芽孢桿菌目Bacillales 芽孢桿菌屬Bacillus、鏈球菌科Streptococcaceae 乳球菌屬Lactococcus、變形菌門中的紅細菌目Rhodobacterales 到紅桿菌屬Rhodobacte?raceae、MNG 科、以及其他零星分布的普雷沃氏菌科Prevotellaceae、球形紅桿菌屬Candidatus_Aquirestis、嗜甲基菌屬Methylotenera、單胞菌屬Polaromona和Limnohabitans屬。

圖5 斑點叉尾鮰養殖池塘四季間差異性菌群多物種線性差異判別分析Figure 5 LEfSe identified the most differentially abundant taxa in the channel catfish pond among four seasons

2.5 細菌群落變化影響因素

與樣本菌群組成相關的環境因子很多，但其中部分因子存在共線性，所以先進行篩選，保留相互作用較小的環境因子。方差膨脹因子（Variance inflation factor，VIF）分析表明自變量間的多重共線性關系嚴重，過濾掉VIF 大于20的環境因子NO-3-N 和Chl a，多次篩選后，剩下的環境因子對應的VIF 值全部小于20。Monte Carlo 排序檢驗表明Temp、TDS、pH、NO2-N、TOC與細菌群落之間存在顯著的相關性（P＜0.05）。這5個因子對細菌群落格局的影響大?。╮2）依次順序是：TDS＞Temp＞pH＞NO-2-N＞TOC（表2）。

利用前置檢驗挑選出來的5 個與細菌群落顯著相關的環境因子進行RDA 排序分析，結果表明，RDA1 軸和RDA2 軸分別解釋了細菌群落變異的44.53%和10.98%，主要菌群被聚為2 簇（圖6）。第1簇由冬季和春季樣品組成，第2 簇由夏季和秋季樣品組成，兩簇被RDA2軸分隔。其中，第1簇冬春季樣本分布比較緊密，主要受pH、TOC和TDS的影響；第2簇夏秋季樣本分布較為分散，且夏秋季樣品被RDA1 軸分 隔，主 要 受NO-2-N 和Temp 的 影 響。RDA 結 果 顯示，斑點叉尾鮰養殖池塘水體微生物具有比較明顯的季節性，4個季節的樣品沿著RDA1軸從左往右排列。

3 討論

本文通過分析斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落的年度變化過程，闡明斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落的變化規律。研究表明，養殖池塘的微生物群落與營養鹽、水質、養殖對象及日常管理都具有重要的關系[3]。本研究結果表明，斑點叉尾鮰養殖池塘水體優勢菌群為藍藻門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門，與三疣梭子蟹和吉富羅非魚養殖塘水體較為相似，但是主要優勢菌群的相對豐度排序略有差別[17-18]。不同養殖品種，甚至同一養殖品種的不同養殖階段，其養殖水體的微生物群落都有明顯的差別，這與養殖對象的棲息方式、食性特征以及養殖周期等差異有關[18]。斑點叉尾鮰和吉富羅非魚養殖過程中投餌量大，產生大量的殘餌和糞便，往往造成過量的營養物輸入至養殖池塘，同時，斑點叉尾鮰和羅非魚都是底棲性魚類，因此優勢細菌群落較為相似。

ANOSIM 檢驗表明斑點叉尾鮰養殖池塘水體4個季度樣品間細菌群落組成存在顯著性差異（P＜0.01），NMDS 分析（圖2A）也驗證了所有樣本呈現出較好的季節性排列趨勢。斑點叉尾鮰養殖池塘水體優勢菌中，擬桿菌門相對豐度冬春季顯著高于夏秋季節，LefSe 分析進一步表明，主要差異菌群為冬季的普雷沃氏菌科Prevotellaceae、球形紅桿菌屬Candida?tus_Aquirestis。普雷沃氏菌科Prevotellaceae 能夠利用和降解蛋白質及各類有機物[19]，而斑點叉尾鮰養殖池塘的總有機碳顯著高于夏秋季節，為普雷沃氏菌科細菌的繁殖提供了適合的環境。球形紅桿菌屬Candi?datus_Aquirestis廣泛分布于內陸高硬度水體，冬春季也會在自然水體中形成明顯的生物量高峰，秋冬季則維持較低的豐度[20]，與斑點叉尾鮰養殖池塘水體的明顯季節性變化一致。

表2 環境因子對排序結果的相關性系數及顯著性檢驗值Table 2 Coefficient correlations between physicochemical parameters and RDA axis

圖6 細菌群落與環境因子之間的RDA分析Figure 6 RDA bioplot of the distribution of bacterial community and environmental variables

藍藻門作為廣泛分布于各類水體的細菌門類，其豐度狀況與水體富營養化程度密切相關。水產養殖環境中，因為營養鹽和有機物的密集投入，水體長期維持富營養化狀態，藍藻水華爆發已經變得越來越頻繁[21]。斑點叉尾鮰池塘的藍藻含量雖然沒有發現顯著的季節性差異，但是其相對豐度依然存在季節性的變化規律。春季3月和夏季7月斑點叉尾鮰養殖池塘出現了兩次藍藻生物量的高峰，藍藻生物量占總細菌生物量的49.98%和56.77%，同時，3 月和7 月藍藻生物量的上升導致池塘水體細菌群落α 多樣性顯著降低。LefSe分析表明，春、夏和秋季藍藻門的顯著優勢菌群各不相同。春季優勢藍藻主要是念珠藻目的g__norank_f__FamilyI_o__SubsectionIV屬，大 都 呈 絲狀，形成厚壁孢子，在長換水周期、高pH、高溫和高光照強度等條件下，更具有優勢[22]。斑點叉尾鮰養殖池塘水體沒有劇烈波動，冬春季pH 一直較高，3 月末溫度已經接近15 ℃，營養鹽也一直維持較高濃度，因此在3月末，藍藻迅速生長，并導致了葉綠素a濃度的上升。之后4 月藍藻大量死亡并氧化分解，消耗水體溶氧并產生乳酸等酸性物質，導致4 月池塘溶氧含量降低，pH 也略有下降。夏季優勢的顫藻屬Oscillatoria是常見的淡水藍藻群體，呈絲狀不分枝，會節律性顫動。斑點叉尾鮰養殖池塘水體夏季顫藻屬快速生長，成為優勢類群，并在7 月形成藍藻水華的最高峰，此時池塘水體葉綠素a 濃度也是全年最高，這個過程與開放湖庫的夏季藍藻水華演替較為相似[23]。秋季g__norank_f__FamilyI_o__SubsectionI屬的藍藻替代顫藻屬成為優勢藍藻類群，該屬歸屬于藍藻綱Subsection I，皆為單細胞藍藻，有空泡，并合成藻膽蛋白，是湖泊、水庫等天然水體中秋季常見的水華藍藻種類[24]。

Monte Carlo 檢驗和RDA 排序分析表明斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落與環境因子間具有顯著的相關性，主要的環境因子包括TDS、Temp、pH、NO-N和TOC。5 個環境因子都表現出明顯的季節性差異，冬春季的TDS、pH 和TOC 顯著高于夏秋季，Temp 和NO-N 則是夏秋季顯著高于冬春季。其中，TDS 和Temp 對細菌群落的影響最大。TDS 能干擾水體的氧傳遞和降低細菌活性，從而影響硝酸鹽、有機物和COD 的去除[25]。大量的研究都表明溫度對細菌群落組成有重要影響。溫度會影響細菌降解有機物、再生營養以及參與微食物鏈等方面的生物學功能[26-27]，同時還對水體浮游植物的演替產生影響，改變水體微生態系統[28]，從而驅動細菌群落組成的改變。水溫季節性的波動造成棲息環境的季節性變化，進一步推動水體細菌群落組成呈現出季節性的響應[29]。此外，不同菌群對溫度的敏感差異，也會導致不同溫度下細菌群落結構的差異[30]。斑點叉尾鮰養殖池塘春季和夏季的水溫升高提高了藍藻門的生長速率，并給藍藻門帶來了競爭優勢[31]，最終與其他因素共同導致斑點叉尾鮰養殖池塘3月和7月的兩次藍藻爆發。

pH 被認為是生物化學地球轉換過程中重要的調控因子，它能調節水體中離子和微量金屬的利用率，從而對細菌的生長起到抑制或者促進的作用[32]。養殖水體光合作用的強弱對pH影響較大，因此pH會隨著光照強度和初級生產力的改變呈現出明顯的季節性變化。本研究中pH 冬春明顯高于夏秋，這可能與本試驗池塘水體初級生產力相對較低有關，葉綠素a濃度明顯低于草魚、烏鱧和羅非魚等品種的養殖池塘[33-34]。同時，夏季池塘補水量大，可能也會引起pH的降低。N 和P 一直被認為是細菌和浮游植物生長的限制性因子[35]，TOC 也被認為能夠直接影響細菌的生物量和組成，從而改變細菌群落結構[36]。然而，斑點叉尾鮰養殖水體一直呈人為的富營養化狀態，大部分的營養鹽（TN、NH-N、NO-N、TP 和PO-P）都沒有對細菌群落結構的塑造起到顯著性作用。而NO-N是水體中氮素存在的一個中間態，本研究池塘溶氧持續充足，整個養殖年度內NO-N 濃度一直維持在較低的狀態。因此，NO-N的低濃度加上夏秋高冬春低的波動，會對細菌群落如亞硝酸鹽硝化細菌等產生顯著的影響。斑點叉尾鮰養殖池塘水體的C/N[可由TOC（/NH-N+NO-N+NO-N）粗略計算]只有7～14，遠低于細菌生長的最適范圍20～30[37]，因此C（主要是TOC）是斑點叉尾鮰養殖池塘細菌生長的限制因子。擬桿菌門的菌群能夠高效利用低碳物質[38]，冬春季的TOC 濃度顯著高于夏秋季節（P＜0.05，表1），因此冬春季的擬桿菌門Bacteroidetes 豐度也顯著高于夏秋季。

4 結論

本研究運用16S rDNA 擴增技術研究斑點叉尾鮰養殖池塘微生物群落，結果表明斑點叉尾鮰養殖池塘水體細菌群落結構呈現出季節性變化，優勢菌群為藍藻門、放線菌門、變形菌門和擬桿菌門。環境因子中，總溶解性懸浮物、水溫、酸堿度、亞硝酸鹽和總有機碳對水體細菌群落結構有顯著的影響。但是本研究局限于一個地方的斑點叉尾鮰池塘主養模式，而斑點叉尾鮰養殖已經遍布全國，因此，后續研究仍需進一步針對斑點叉尾鮰的不同養殖模式在不同地域開展大尺度的養殖池塘微生物群落結構比較，從而為不同地域不同模式的斑點叉尾鮰養殖管理提供精確理論指導。