泛素樣含PHD和環指域1在結腸癌組織表達陽性率與臨床病理參數相關性分析

王 穎

南方醫科大學深圳醫院腫瘤科，廣東 深圳 518000

結腸癌是一種發生率很高的惡性腫瘤，在我國結腸癌的發生率要比國外一些發達國家低，但最近幾年，由于人們不良的飲食和生活習慣，結腸癌的發生率呈逐年上升的勢頭［1-2］。泛素樣含PHD和環指域1（UHRF1）在很早之前就已經被研究者發現，其與細胞的生長關系緊密相關，是一種核蛋白基因，參與細胞周期、繁殖和凋亡等一系列人體生化反應，其可結合半甲基化DNA、甲基化組蛋白H3K9，之后再結合DNA生長點，繼而將DNA甲基轉移酶1（DNMT1）引到生長點對新生鏈DNA的甲基化過程進行催化，繼而保證甲基化譜式遺傳的精準度［3-6］。當前UHRF1在結腸癌組織中的表達水平與臨床病理參數相關性的研究較少，本文研究旨在對UHRF1蛋白在結腸癌組織中的表達水平進行檢測，分析該種蛋白與臨床病理參數的相關性，旨在研究這種蛋白與腫瘤轉移情況、浸潤深度之間的關系，指導結腸癌放化療方案的制定，現將研究結果報告如下。

1 一般資料

1.1 標本來源

使用上海芯超結腸癌芯片結腸癌HColA150CS02作為研究對象，男性44例，女性31例，年齡在26～83歲，平均年齡為（62.37±12.6）歲，根據美國聯合癌癥分類委員會（AJCC）制定的TNM分期標準：36例在Ⅰ～Ⅱ期，39例在Ⅲ～IV期；11例處于高分化狀態，47例處于中分化狀態，17例處于低分化狀態。

1.2 實驗儀器

彩色全自動圖像分析儀、光學顯微鏡石蠟切片機、撈片機、烤片箱、電磁爐、高壓鍋、冰箱等。

2 方法步驟

2.1 切片

2.1.1 切片前準備：用洗滌液先將載玻片、蓋玻片清洗干凈并烘干，之后將載玻片、蓋破片分別置于濃硫酸中8～12 h、6 h，將兩種破片取出后用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水沖洗干凈，之后將兩種玻片泡于95%的乙醇中，第二天將其取出烘干，放置在盒中備用。為了防止免疫組織染色時切片脫片，在貼片之前，用玻片硅化試劑涂于載玻片上，烘干備用。

2.1.2 石蠟切片制備：用石蠟切片機切片，每片標準厚度為4μm，使用載玻片將切片撈出，置于切片架上，為了防止脫片，將切片放置在溫度為人體正常體溫的箱內，第二天再取出。

2.2 免疫組織染色

（1）將切片放入烤片機中進行高溫烘烤，時間為10～60 min，直至切片上的石蠟被全部烘干。試劑：鼠抗人UHRFl單克隆抗體（1:150稀釋，購自美國Abcam公司）；通用免疫組織化學SP試劑盒和DAB顯色試劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。（2）按下述順序沖洗：用二甲苯I、二甲苯II各沖洗15 min，100酒精I、100%酒精II各沖洗5 min，95%酒精、90%酒精、80%酒精、50%酒精各沖洗5min，PBS溶液沖洗3次，3min/次。（3）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，將切片置于高壓鍋中，加入0.1M枸櫞酸鹽緩沖液（酸堿值為6.0），直至溶液完全沒過切片，加熱20min左右直至溶液沸騰，自然冷卻10 min左右，之后用PBS每次沖洗切片5 min，共3次。（4）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入大約10μL的一抗（UHRF1、DPD和Ki-67），將切片置于冰箱中，4℃冷藏，次日將切片取出，用PBS溶液每次沖洗5 min，總共沖洗3次。（5）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入40μL HRP標記過的IgG，人體正常體溫下孵育10 min，用PBS沖洗5 min/次，共3次。（6）用蒸餾水沖洗，清除殘留在切片上的PBS液體，每張切片滴入現配制的DAB顯色劑60μL，室溫無光條件下顯色，用光學顯微鏡進行觀察，在合適的時間用自來水停止反應（此過程約為2～5 min）。（7）用蘇木精染色，重復操作60 s，自來水沖洗，用1%鹽酸酒精分化液將組織過多結合的染色劑脫去，1%氨水使蘇木素染上的細胞核呈現藍色，用自來水沖洗。（8）將切片按順序放于50%濃度酒精、80%濃度酒精、90%濃度酒精、95%濃度酒精中各脫水5 min，用100%酒精I、100%酒精II各脫水10 min，二甲苯I、二甲苯II各透明10 min，采用中性樹膠粘合劑進行封片。

陰性對照：用免疫組織染色方法進行染色的切片；陽性對照：用已知的結腸癌陽性組織切片。每個切片同時設置陰性和陽性對照。

2.3 試驗結果判定

由兩名經驗豐富的醫師在不知情的情況下對各組染色切片進行觀察并判斷。觀察：每個切片隨機選擇高倍鏡（×100）下的5個視野，每個視野計細胞數200個。判斷：UHRF1大多染色于胞質和胞膜，陽性染色的細胞占比為0，則為0分，陽性細胞＞0～25%計為1分，陽性細胞≥25%～50%計為2分，陽性細胞≥50%～75%計為3分，陽性細胞≥75%計為4分。無陽性染色為0分，呈現淺黃色為1分，在淺黃色與棕黃色間為2分，呈現深黃色為3分。最終分數為上述兩項的乘積，陰性（-）記為0分，弱陽（+）記為1～4分，中陽（++）記為5～8分，強陽（+++）記為9～12分。

2.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析，三種蛋白的表達陽性率為計數資料，采用χ2檢驗，各指標的相關性分析采用Pearson分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 UHRF1蛋白在結腸癌組織與正常結腸組織中的表達

UHRF1高表達于胞質和胞膜，UHRF1蛋白結腸癌組織中的陽性表達率為64.00%（48/75）高于正常結腸組織中的陽性率表達28.00%（21/75），差異有統計學意義（χ2=19.57，P＜0.05）。

3.2 UHRF1蛋白在結腸癌組織中的表達與臨床病理參數的關系

UHRF1蛋白結腸癌組織中的表達情況均與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度的臨床病理參數不存在相關關系，差異無統計學意義（P＞0.05），與浸潤深度、TNM分期、是否發生淋巴結轉移存在相關性，浸潤深度與TNM分期呈負相關關系，腫瘤發生轉移，UHRF1蛋白的陽性表達率會隨之升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 UHRF1在結腸癌組織中的表達與臨床病理參數的關系

4 討論

UHRF1蛋白高表達于增值分裂的細胞，但在處于靜止狀態的細胞卻呈現出低表達狀態［7-8］。本實驗采用免疫組化的試驗方法，實驗結果顯示UHRF1在結腸癌組織中的表達顯著高于正常組織，UHRF1的表達與浸潤深度、TNM分期呈正相關關系，UHRF1在發生轉移的結腸癌組織中其陽性表達率比未發生轉移的高，證明了UHRF1在結腸癌組織中的表達與淋巴結轉移情況相關。

本文實驗采用免疫組化的方法，分析UHRF1蛋白在結腸癌組織中表達間的關系，發現UHRF1蛋白結腸癌組織的陽性表達率均顯著高于正常結腸組織的陽性表達率，UHRF1蛋白結腸癌組織的表達情況與浸潤深度、TNM分期具有正相關性，UHRF1蛋白在發生轉移的結腸癌組織中陽性表達率均高于未發生轉移者，說明UHRF1蛋白與結腸癌的產生、發展及預后息息相關。綜上所述，UHRF1對提升結腸癌患者的臨床診斷敏感度具有一定的價值，可指導放療、化療方案的制定以及預后情況的判斷。