黃連素調節非小細胞肺癌細胞糖酵解水平并抑制A549細胞EMT的發生

吳國成 陳煥

與正常組織細胞相比，腫瘤細胞除了具有無限增殖能力、失去接觸抑制以及遷移能力外，代謝的重排也是惡性腫瘤的另一重要特征。為適應腫瘤的增殖、侵襲以及逃避機體免疫系統的殺傷等，即使在有氧條件下腫瘤細胞也會主動選擇糖酵解作為獲取能量的方式，即Warburg效應[9-11]。上皮細胞間質化(epithelial-mesenchymal transition， EMT) 是腫瘤細胞增強其侵襲和遷移能力的表現之一[12]。有研究表明，多種癌癥類型中可見上皮細胞間質化，誘導代謝相關酶的表達和活性改變，進而影響腫瘤細胞的代謝特征[13-15]。還有研究顯示，腫瘤細胞代謝相關調節酶的改變，同樣可以反饋性的阻斷或增強EMT效應，進而增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力并導致轉移的發生[16-18]。

本研究旨在探討BBR對肺腫瘤細胞A549的增殖和侵襲能力的影響，并探索BBR抑制A549細胞侵襲遷移的相關機制。

材料與方法

一、實驗試劑

純度大于99%的BBR購自TCI化成工業發展有限公司(中國上海)。CCK8細胞活性檢測試劑盒購自Dojindo(日本)。 Anti-Vimentin (Proteintech, cat# 10366-1-AP); Anti-E-cadherin (Proteintech, cat # 60335-1-lg; 1 ∶1000); Anti-N-cadherin (Proteintech, cat #22018-1-AP; 1 ∶1000); Anti-β-catenin(CST, cat #8480; 1 ∶1000)；Anti-Fibronectin(Abcam, cat #ab32419; 1 ∶1000)；Anti-HK2 (CST, cat #2867; 1 ∶1000); Anti-Glut1 (CST, cat #12939S; 1 ∶1000); Anti-β-actin (CST, cat #3700; 1 ∶10000)；Matrigel (Corning, cat #356234)。

二、實驗方法

1 CCK8細胞活性檢測：CCK8細胞增殖活性檢測操作步驟如說明書所述。大致步驟如下：96孔板中每孔加入含3000個細胞的細胞懸液100μl，繼續培養24h；細胞貼壁后加入不同濃度的BBR孵育3 d；每孔加入10ul CCK8試劑并孵育40 min左右；酶標儀測量OD值。

2 細胞遷移實驗：本實驗采用8μm孔徑的Transwll小室(Corning)。上室中加入5×104的細胞懸液，下室中加入含血清的完全培養基以促進細胞移動。常規培養(37℃，20% O2, 5%CO2)24h后，使用棉簽擦拭掉未透過小室的細胞。1%結晶紫染色，使用光學顯微鏡(Olympus)拍攝圖像。隨機選擇3張50倍放大圖像，使用ImageproPlus軟件對遷移的細胞數量進行統計分析。

政府早已認識到兒科醫護人員的巨大人才缺口,開始從各個方面增加兒科醫護人員配置,對于加強兒童醫療衛生服務提出了多方面的建議:兒科醫護人員國家免費培養;提高兒科醫護人員收入水平,健全以服務質量、數量和患者滿意度為核心的內部分配機制,做到優績優酬、同工同酬,確保兒科醫務人員收入不低于本單位同級別醫務人員收入平均水平;新改擴建兒童醫院,新增兒科床位,建立健全功能明確、布局合理、規模適當、富有效率的兒童醫療衛生服務體系;加強兒科醫務人員隊伍建設,增加每千名兒童兒科執業(助理)醫師數等等。采用各種方式變相增加兒科醫護人員編制,減輕兒科醫護人員工作量。

3 細胞侵襲實驗：10 ∶1稀釋Matrigel基質膠，鋪設于上室底部，待基質膠凝固后加入2×105的細胞懸液。室中加入含血清的完全培養基以促進細胞移動。常規培養(37℃，20% O2, 5%CO2)48h后，使用棉簽擦拭掉未透過基質膠的細胞。1%結晶紫染色，使用光學顯微鏡(Olympus)拍攝。隨機選擇3張50倍放大圖像，使用ImageproPlus軟件對侵襲的細胞數量進行統計分析。

4 劃痕實驗：6孔板中每孔加入1×105的A549細胞，正常培養24 h后，待細胞完全貼壁且生長密度至80%～90%左右，更換無血清培養基。在細胞間劃出0.5 mm寬的間隙，光鏡(Olympus)拍攝。常規培養(37℃，20% O2, 5%CO2)24h后再次拍攝，對比觀察細胞遷移情況。

5 免疫印跡實驗：提取對照組及BBR處理組A549細胞蛋白，Western Blot檢測N-cadherin、E-cadherin、Vim、Fibronectin、β-catenin、HK2等蛋白的表達水平。

6 RT-PCR：RNA快速提取試劑盒提A549細胞RNA，使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 試劑盒進行逆轉錄。按照SYBR RT-PCR Kit 說明書要求，配制定量PCR反應體系，實時熒光定量PCR下檢測AIM2和CASPI基因表達水平。記錄并保存Real-time PCR擴增基因片段的擴增曲線和解鏈曲線。

7 代謝通量測定： 胞外產酸率(extracellular acidification rate, EACR)使用Seahorse XF96 細胞外通量分析儀(Seahorse Bioscience) 檢測，ECAR的單位為mph/min。

結 果

一、不同劑量的BBR對A549細胞增殖活性產生不同的影響。

CCK8實驗檢測A549細胞在4μmol/L～64μmol/L濃度的BBR作用下增殖活性的變化(圖1)。結果顯示，較低劑量的BBR(4μmol/L、8μmol/L)具有輕微的促進A549細胞增殖活性的能力(P<0.05)，高劑量BBR(32μmol/L、64μmol/L)能夠顯著抑制A549的細胞增殖能力(P<0.05)。因低劑量BBR具有促進肺癌細胞增殖的能力，而高劑量的BBR表現為細胞增殖抑制活性，因此后續研究選擇高劑量BBR作為干預組，研究BBR對A549細胞遷移侵襲能力的影響，從而整體的探討應用BBR使肺癌患者獲益的可能性(包括抑制腫瘤細胞增殖和遷移)。同時，與32μmol/L的BBR組相比，64μmol/L的BBR對A549細胞增殖能力的影響未見顯著差異(P>0.05)，因此選擇32μmol/L的BBR作為后續研究遷移實驗的主要濃度。

圖1 BBR作用下A549細胞增殖活性

二、高劑量BBR顯著抑制A549細胞侵襲和遷移能力。

為進一步了解黃連素對肺癌轉移的作用，我們進一步展開了侵襲和遷移實驗(圖2)。結果顯示，高劑量BBR(32μmol/L)能夠顯著降低A549細胞遷移和侵襲的能力(P<0.05)。

圖2 高劑量BBR抑制A549細胞侵襲和遷移

三、BBR抑制A549細胞發生EMT。

使用Western blot檢測高濃度BBR作用下A549細胞內EMT相關蛋白的表達變化(圖3&表1)。結果顯示，與對照組相比，高濃度BBR作用組間質標記物N-cadherin及Vimentin等蛋白的表達顯著下降，(P<0.05)，差異有統計學意義。

表1 不同濃度BBR對A549細胞增殖能力的影響

圖3 高劑量BBR抑制A549細胞發生EMT

四、BBR顯著下調A549細胞糖酵解水平

大量研究顯示腫瘤細胞的代謝重排是腫瘤細胞適應自身增殖和轉移需求的表現之一。我們進一步檢測了BBR對A549細胞糖酵解相關酶的表達轉錄情況,結果顯示，BBR能夠下調A549細胞內以HK2為主的糖酵解活性酶的基因水平(P<0.05)。代謝通量檢測結果顯示，高劑量BBR作用下，A549細胞葡萄糖有氧氧化水平下調，胞外產酸率顯著增加(P<0.05)，提示高劑量BBR抑制了A549細胞的糖酵解水平。而使用重組HK2能夠阻斷BBR對A549糖酵解水平的抑制(圖4)。

表2 高劑量BBR對A549細胞侵襲和遷移能力的影響

圖4 BBR顯著下調A549細胞糖酵解水平

五、BBR通過調節A549細胞糖酵解水平抑制A549細胞侵襲和遷移

為明確BBR對A549細胞糖酵解水平的調節與抑制A549細胞EMT之間的關系，我們進一步檢測了HK2的應用對BBR作用下A549細胞侵襲和遷移能力的影響(圖5)。結果顯示，HK2能夠顯著阻斷高劑量BBR對A549細胞侵襲和遷移活性的抑制作用(P<0.05)，差異有統計學意義。

圖5 BBR通過調節A549細胞糖酵解水平抑制A549細胞侵襲和遷移

表3 高劑量BBR對A549細胞內EMT相關蛋白表達水平的影響

討 論

肺癌的轉移是指腫瘤細胞從肺部原發病灶脫落并擴散到肺內其他部位或遠處器官的過程，在肺癌相關死亡率中占90%以上。肺癌轉移的過程十分復雜，涉及原發腫瘤灶侵襲周圍組織，癌細胞脫落后入侵進入微血管，通過血液或淋巴管進行遷移，種植于機體遠處器官或組織并繼續增殖，最終形成繼發性腫瘤灶[19-20]。因此，充分了解控調節肺癌轉移的基本機制，發現可用于癌癥治療的腫瘤細胞弱點至關重要。

EMT是一個活躍于胚胎發生和組織修復的跨分化過程，被認為是腫瘤發生和轉移擴散進程中的關鍵環節。在EMT過程中，上皮細胞失去了細胞與細胞，細胞與間質之間的連接結構和相互作用，上皮細胞特征逐漸消失，并獲得更多的間質特性。發生EMT的細胞形態、行為發生改變，E-cadherin、β-catenin等上皮標記表達降低；細胞Vimentin、N-cadherin及Fibronectin表達顯著上調，運動能力和侵襲能力均顯著增加[21]。在腫瘤發生發展的背景下，EMT代表了一系列重要的表型和信號的改變，反映了腫瘤細胞從快速增殖到維持存活和轉移的需求轉變。因此，為了支持新的細胞狀態，該過程必然伴隨著細胞代謝程序的重新編輯。

葡萄糖是維持細胞生存和生命活動的主要能量來源。大多數腫瘤細胞獲取ATP的方式與正常組織細胞不同。在常氧條件下，腫瘤細胞會優先選擇糖酵解途徑，而不是選擇能量效率更高的葡萄糖氧化磷酸化途經，這一現象被稱為Warburg效應。盡管Warburg效應的能量效率較低，但其從分解葡萄糖開始到產生ATP的路徑更短，同時能夠獲取大量的糖酵解產物，如乳酸以及其他有利于腫瘤細胞生長、存活和轉移的蛋白質、核酸、脂質和其他生物大分子[22]。

研究表明，腫瘤細胞的代謝重排與EMT過程及腫瘤的轉移密切相關[12,18]。本研究中，我們發現高濃度BBR可以通過抑制A549細胞EMT的發生從而發揮抑制腫瘤侵襲和轉移的作用。有趣的是，我們還注意到高濃度BBR抑制A549發生EMT可能是以調節細胞代謝水平的方式實現的。應用BBR后，A549細胞的ECAR和OCR明顯降低，細胞的糖酵解水平受到抑制。PCR結果顯示BBR顯著下調HK2及LDHA基因表達，使用重組己糖激酶HK2能夠顯著阻斷黃連素對EMT的抑制作用，提示BBR抑制A549細胞EMT的發生是HK2依賴的。

綜上所述，本研究結果顯示BBR具有出色的抑制肺癌A549細胞侵襲和轉移的功效，并揭示了該進程的相關機制，為肺癌的治療提供了新的理論依據和實驗基礎。