蒲公英總黃酮對烏拉坦誘導小鼠肺癌腫瘤相關巨噬細胞及肺部微環(huán)境的影響

李琴琴 李梅 王明 李小青

目前，臨床上治療肺癌的方式雖然取得較大進步，但是臨床使用中仍然存在較大限制，肺癌的總體治療效果仍然難以令人滿意，患者生存期短，生存質量難以得到保障[1]。腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，腫瘤微環(huán)境中的基質細胞與免疫抑制細胞及它們表達或分泌的相關蛋白與細胞因子，可通過多種方式促進腫瘤的生長及轉移。研究表明[2]，腫瘤微環(huán)境對腫瘤的作用是復雜的，不僅可以使癌細胞產生免疫逃逸，還能夠促進癌細胞的轉移和侵襲，同時腫瘤微環(huán)境還可誘導癌細胞對傳統的抗癌療法產生耐藥。蒲公英黃酮類提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗血栓、降血脂、降血糖和改善血液循環(huán)等藥理作用[3]。研究證明，蒲公英能夠增強機體的免疫能力，改善腫瘤患者的預后，具有抗腫瘤作用[4]，動物實驗證明，蒲公英總黃酮能調節(jié)小鼠體液免疫功能，改善小鼠組織及血液循環(huán)系統內部微環(huán)境[5]。化療作為治療肺癌常規(guī)手段之一，雖可顯著抑制腫瘤細胞增殖，但對患者機體產生嚴重侵害，惡化其生存質量，臨床上研究者已經開始尋找其他非化療替代手段。本研究采用烏拉坦誘導小鼠肺癌疾病模型，以常規(guī)化療藥物干預為參照，觀察蒲公英總黃酮對肺癌腫瘤微環(huán)境的影響及作用特點。

資料與方法

一、實驗動物

C57BL/6小鼠，雄性，45只，SPF級，4～6周齡，體重(20±2)g，無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)級別，購自中山大學實驗動物中心(許可證號：SCXK(滬)2016-0003)，于XXX實驗動物中心SPF級別動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)(實驗單位使用許可證編號：SYXK(瓊)2015-0075)。

二、主要試劑與儀器

烏拉坦(純度99%，CAS貨號：51-79-6)購自江蘇倍達醫(yī)藥科技有限公司。蒲公英總黃酮(純度85%以上，9.4g/袋，批號:1411347，使用選擇蒸餾水配成濃度為5 mg/mL的藥液)由上海中醫(yī)藥大學藥學院提供。順鉑注射液(20 mg/瓶，批號:1WA2A1403021B)購自齊魯制藥有限公司。Hyclone DMEM 糖培養(yǎng)液，抗小鼠CD206多克隆抗體、SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；VEGF、IL-2、TNF-αELISA試劑盒均購自武漢新啟迪生物科技有限公司；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白含量檢測試劑盒均購自江蘇凱基生物股份有限公司；鼠抗Bcl-XL、Bcl-2購自美國 Santa Cruz 公司；兔抗細胞凋亡抑制蛋白 1(Anti-apoptotic protein 1，cIAP1)、兔抗 Survivin均購自英國 Abcam公司；鼠抗β-actin購自美國 Sigma 公司。HRP結合的羊抗兔購自美國 Santa Cruz公司；HRP 結合的兔抗鼠購自丹麥Dako公司。酶標儀(iMark 680，美國)；電泳儀(PowerPacBasic，Bio-Rad，美國)；漩渦混合儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；磁力攪拌器(上海蒲江分析儀器廠)；化學發(fā)光成像分析系統(5200 Multi，Tanon，日本)；超速低溫離心機(Micrifuge 20 R Centrifuge，Beckman Coulter，美國)；培養(yǎng)箱(Direct Heat CO2Incubator 37℃，5.0%CO2，Themo，美國)；超凈細胞工作臺(蘇凈集團安泰公司)；光學倒置顯微鏡(Olympus，日本)；HH-42快速恒溫數顯水浴箱(常州國華電器有限公司)；電子天平(JJ 3000，G&G，美國)；電子游標卡尺(桂林廣陸數字測控股份有限公司)。

三、 造模方法及分組給藥

45只小鼠采取隨機數字表法分成模型對照組、蒲公英總黃酮組、化療組，每組15只。其中模型對照組、蒲公英總黃酮組、化療組建立肺癌小鼠模型。建模方法[6]：小鼠腹腔注射烏拉坦800mg/kg，2次/周，連續(xù)注射5周。分組結束后第2 d開始給予藥物治療。模型對照組給予同等劑量生理鹽水0.4 mL灌胃，蒲公英總黃酮組給予100 mg/kg的蒲公英總黃酮液灌胃，給藥體積為 0. 4 mL/d(含生藥0.6g)，每日1次，連續(xù)18 d。用藥第1、3、5 d，模型組及蒲公英總黃酮組予以生理鹽水1 mL腹腔注射，化療組選擇含常規(guī)化療藥物順鉑生理鹽水溶液1 mL(含順鉑0.1 mg)腹腔注射。第19 d，稱重后脫頸椎處死各組小鼠，摘肺臟、脾臟和眼球，取眼球血。

四、腫瘤組織形態(tài)學觀察

記錄給藥前和給藥19 d后，小鼠的體重變化，并在給藥第19 d，處死小鼠記錄其脾臟重量，計算小鼠脾臟指數，脾臟指數(mg/g)=脾臟重量/體重×100%。取肺組織約3g，用4%甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，上全自動切片機連續(xù)切片，片厚約4μm，常規(guī)HE染色，(×200)光鏡下觀察并攝片。

五、測定小鼠肺部炎性細胞水平

在小鼠存活狀態(tài)下，各組選取5只小鼠經氣管行PBS 灌注，收集支氣管肺泡灌洗液。采用血細胞計數儀檢測各組小鼠WBC總數，離心涂片后，觀察各組小鼠每視野下100個白細胞的中性粒細胞及淋巴細胞情況。

六、ELISA法檢測肺癌小鼠外周血內VEGF、IL-6和TNF-α水平

每組選取5只小鼠進行眼眶采血，3200 rpm，離心10 min，離心半徑5.6 cm，取上清液，采用ELISA法檢測模型組、蒲公英總黃酮組、化療組小鼠瘤體中VEGF、IL-6、TNF-αELISA水平變化，實驗步驟按照試劑盒說明書操作。

七、免疫組化染色觀察小鼠腫瘤相關巨噬細胞CD206形態(tài)學變化

各組隨機選取5只小鼠，取肺部腫瘤組織，質量分數為4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，免疫組化染色后，200倍光鏡下觀察各組小鼠腫瘤相關巨噬細胞CD206陽性結果，陽性結果標準：巨噬細胞胞質內棕黃色或黃褐色顆粒CD206陽性巨噬細胞。

八、Western blot法檢測各組小鼠瘤體中抗凋亡及增殖相關因子的水平

取血后脫頸椎處死小鼠，分別剝取模型組、各治療組小鼠瘤體組織，-80℃冷存?zhèn)溆?。采用Trizoll法提取各組小鼠瘤組織的總蛋白，BCA法檢測蛋白的濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉后，分別加入相應的一抗、二抗，ECL發(fā)光液進行顯影，X線膠片曝光，采用Image-Pro Plus軟件進行圖像目的條帶的灰度值分析，以β-actin為內參，計算Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1、Survivin蛋白的相對表達量。

九、統計學方法

結 果

一、HE染色結果

HE染色結果顯示，烏拉坦誘導肺癌小鼠肺部浸滿排列密集的腫瘤細胞，見圖1B，化療組肺癌小鼠肺組織可見腺癌腺圈，但腫瘤細胞相對較少，見圖1A，蒲公英總黃酮組內存在腫瘤浸潤細胞略多于化療組小鼠肺組織，見圖1C(見圖1)。

圖1 小鼠肺組織HE染色(×200) A：化療組 B：模型對照組 C：蒲公英總黃酮組

二、各組小鼠實體瘤生長情況比較

治療后，蒲公英總黃酮組和化療組小鼠的體重和脾臟指數高于模型組(t=7.441，P<0.01；t=4.008，P=0.0004)，蒲公英總黃酮組和化療組小鼠的體重和脾臟指數比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠實體瘤生長情況比較

三、各組小鼠腫瘤組織巨噬細胞CD206比較

模型對照組小鼠腫瘤組織中可見大量清晰褐色巨噬細胞CD206，細胞核深染，核體積增大，且輪廓清晰。蒲公英總黃酮組及化療組腫瘤細胞黃色和褐色巨噬細胞CD206比例減小，可見部分腫瘤細胞壞死、凋亡，核皺縮，核深染的比例減少，核仁小，染色質凝聚等現象(見表2，圖2)。

表2 各組各組小鼠腫瘤組織CD206陽性細胞比例

圖2 小鼠腫瘤組織免疫組化染色(×200)A：化療組 B：模型對照組 C：蒲公英總黃酮組； 注：紅色箭頭指示褐色陽性細胞

四、各組小鼠炎性細胞水平

蒲公英總黃酮組及化療組各WBC總數、中性粒細胞及淋巴細胞水平低于模型對照組(P<0.05)，蒲公英總黃酮組及化療組各WBC總數、中性粒細胞及淋巴細胞水平比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組小鼠炎性細胞水平比較(×104/mL)

五、各組小鼠細胞外周血細胞因子水平比較

蒲公英總黃酮組及化療組小鼠外周血中的VEGF、IL-6、TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.01)。且蒲公英總黃酮組VEGF、IL-6、TNF-α水平顯著低于化療組(P=0.0081)(見表4)。

表4 各組小鼠細胞因子水平比較

六、兩組抗凋亡及增殖相關因子表達情況比較

蒲公英總黃酮組及化療組小鼠Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1、Survivin蛋白的表達低于模型對照組(P<0.01)。蒲公英總黃酮組小鼠Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1、Survivin蛋白的表達與化療組差異無統計學意義(P<0.01)(見圖3、表5)。

圖3 小鼠腫瘤組織抗凋亡及增殖蛋白表達Western blot檢測A：化療組 B：模型對照組 C：蒲公英總黃酮組

表5 小鼠腫瘤組織抗凋亡及增殖蛋白表達

討 論

烏拉坦學名氨基甲酸乙酯，可用于動物麻醉，主要存在于煙草、煙霧中，是一種化學致癌物質，可用于誘導肺癌的發(fā)生。研究表明[7]，烏拉坦一般毒性作用較輕且無劑量蓄積作用，注射后對小鼠攝食、生長發(fā)育和體質量的增長都無明顯影響,其誘導的小鼠肺癌病理學特征與人肺腺癌極其相似。本研究通過對小鼠行烏拉坦800mg/kg腹腔注射，每周兩次，連續(xù)5周以建立小鼠肺腺癌模型，結果顯示，建模后，小鼠肺部浸滿排列密集的腫瘤細胞，呈現典型的肺腺癌特征。因此，本研究進一步確認烏拉坦可建立較理想的小鼠肺癌疾病模型。

腫瘤微環(huán)境在肺癌的發(fā)生和轉移中有重要的作用，研究腫瘤微環(huán)境對理解肺癌的發(fā)生機制以及肺癌防治藥物的研發(fā)，都具有十分重要的意義。蒲公英總黃酮能夠改變腫瘤細胞膜通透性，破壞其細胞膜完整性，導致腫瘤細胞質內金屬離子、蛋白質和糖類物質滲出阻礙腫瘤細胞代謝紊亂，進而影響細胞微環(huán)境而殺死腫瘤細胞[8-12]。本研究結果發(fā)現，蒲公英總黃酮組小鼠肺部腫瘤細胞浸潤數量比模型組明顯減少，表明蒲公英總黃酮可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，作用機制可能是通過NF-κB和STAT3信號通路干預腫瘤相關巨噬細胞(TAM)而實現的。而我們的實驗結果顯示，蒲公英總黃酮可以直接抑制Bcl-XL、Bcl-2、cIAP1、Survivin蛋白的表達，通過促進腫瘤細胞凋亡從而抑制腫瘤細胞的生長。

近年來靶向腫瘤微環(huán)境，尤其是腫瘤組織中的巨噬細胞-腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)成為治療腫瘤的新途徑。在腫瘤微環(huán)境中，至少有兩種不同激活狀態(tài)的巨噬細胞亞群：經典活化的巨噬細胞(M1)和替代性活化的巨噬細胞(M2)。研究表明，M2 型巨噬細胞(表面分子標記物CD206)通過分泌炎癥因子/趨化因子、血管內皮生長因子(VEGF)等細胞活性物質，促進炎癥、刺激血管生成、促進腫瘤細胞的轉移和傳播、減弱抗腫瘤免疫作用促進腫瘤的進展[13]。本研究結果顯示，蒲公英總黃酮可以顯著抑制M2型巨噬細胞(CD206)的數量，減少小鼠體內炎性細胞的數量，降低促炎癥細胞因子的表達。

對于惡性腫瘤的侵襲和轉移，現代醫(yī)學目前還不能很好的解決這個問題。VEGF在大部分實體瘤內高表達，能夠激發(fā)腫瘤內新生脈管的生成，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。研究發(fā)現蒲公英提取物能通過改善膠質瘤VEGF/VEGFR陽性細胞百分比微環(huán)境，抑制膠質瘤腫瘤血管生成[14]。本研究發(fā)現，蒲公英總黃酮顯著降低小鼠瘤體組織中VEGF的表達，且低于順鉑化療組(P=0.0081)，表明蒲公英總黃酮有助于抑制腫瘤的浸潤和轉移。此外，值得注意的是，蒲公英總黃酮組小鼠的體重和脾臟指數高于模型組，表明使用蒲公英總黃酮可增強機體的免疫功能和內在防御能力，體現了中醫(yī)中藥“扶正固本”的精髓和優(yōu)勢。

綜上所述，蒲公英總黃酮方能明顯改善肺癌小鼠生存質量及抑制腫瘤生長，其內在作用機制可能是通過調節(jié)肺癌微環(huán)境，體現扶正祛邪的作用。一方面，通過增強機體的免疫功能達到扶正作用。另一方面，通過抑制Bcl-XL等蛋白的表達，促進腫瘤細胞凋亡，以及抑制M2型巨噬細胞，減輕炎癥反應，達到祛邪作用。本研究可為蒲公英總黃酮方的進一步臨床推廣應用提供重要參考。