靜態頂空氣相色譜-質譜內標法快速測定酒醅中乙醇含量

程 凡 ，張溫清，李 賽，陳官婷，周慧佳，俞東陽，郭志忠，周 萍

（1.安徽宣酒集團股份有限公司科研中心，安徽宣城 242000；2.江南小窖釀造工藝研究所，安徽宣城 242000）

靜態頂空技術（SHS）是色譜分析揮發性成分和半揮發性成分特有的進樣方法[1]，其免除了繁雜的樣品前處理過程，具有操作簡單、花費少、易于自動化的優點，現已廣泛運用于釀造、食品、醫學檢驗等行業[1-7]。

白酒發酵是自然接種、多菌種參與、開放式、長周期的固態發酵。控制發酵的前置條件，如淀粉、水分、酸度、溫度等，對維持發酵啟動微生物菌群結構穩定、后續發酵過程微生物演替、代謝物質的形成、風味物質的轉化至關重要。但一旦進入窖池進行酒精發酵，只能通過監控發酵過程中相關指標，來了解、掌握整個發酵的狀態。酒醅中的乙醇含量作為眾多監測指標之一[8]，其檢測方法依然以傳統蒸餾法為主[9]。近年來，氣相色譜法、質譜法、頂空進樣等以及結合其他檢測方法的普遍使用，為酒醅中乙醇等揮發性成分的檢測分析提供了簡便、快捷、準確的新方法[9-15]，對指導白酒釀造生產具有很重要的意義。

本研究利用靜態頂空進樣技術結合氣相色譜質譜聯用（GC-MS）技術，建立一種內標法測定白酒酒醅中乙醇含量的方法，為白酒釀造過程中乙醇指標監控提供新的檢測途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：白酒酒醅，由安徽宣酒集團股份有限公司提供。

試劑：無水乙醇（分析純，99.7%），購自國藥集團化學試劑有限公司；叔戊醇（≥99.5%），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑為分析純，均購自于國藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：7697A 型靜態頂空進樣器，美國Agilent 公司；GC 7890B-MS 5977A 型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司；Aquapro 2S超純水機，美國艾科浦國際有限公司；ME204E/02 電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制

以無水乙醇為標準品與蒸煮后冷卻的超純水配制0.5%vol、1.0%vol、1.5%vol、2.0%vol、2.5%vol、3.0 %vol 的乙醇系列標準溶液；叔戊醇為內標，內標濃度為5 mL/L。

1.2.2 樣品預處理

稱取2 g 白酒酒醅樣品于20 mL 頂空瓶中，加入10 μL 內標標準液和2 mL 經蒸煮后冷卻的超純水，漩渦振蕩1 min 后置于靜態頂空進樣器中，待分析。

1.2.3 儀器分析條件

頂空進樣器條件：孵育溫度45 ℃，孵育時間2 min，頂空進樣時間0.5 min。

氣相色譜分析條件：色譜柱：VF-WAX ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：160 ℃；載氣為He（≥99.999%），分流比為100∶1，流速為1.0 mL/min；程序升溫條件：40 ℃保持不變2 min，20 ℃/min 至160 ℃，保持5 min。

質譜分析條件：EI離子源，電子能量為70.0 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃。離子監測（SIM）模式，目標物及內標物定性離子、定量離子、保留時間參考表1。

表1 乙醇、叔戊醇的定量離子、定性離子

2 結果與分析

2.1 樣品預處理優化

酒醅中的乙醇能夠在頂空瓶內部體系中得到充分的浸提，在固、液、氣三相中達到平衡狀態至關重要。實驗將酒醅樣品分別以直接揮發、蒸餾和浸提3 種預處理方式進行分析實驗，最終確定以浸提法作為該方法的預處理實驗方案，即樣品中加入一定量經蒸煮后冷卻的超純水，漩渦振蕩后待測。根據1.2.3 實驗方法設定儀器分析條件，對樣品進行GC-MS分析，見圖1。

上述條件下，乙醇得到有效檢出，且色譜峰分離效果好。考慮到固態樣本不均一性，選擇加一定量的超純水，漩渦振蕩，可使內標在平衡體系中與樣品充分混合，優于直接揮發。蒸餾法相對操作復雜，分析效率較低，故未采用。

2.2 分析方法的評價

根據1.2 所示方法，配制乙醇標準溶液，以乙醇峰和內標峰峰面積的相對響應值為縱坐標，乙醇和內標物相對濃度為橫坐標，建立內標法測定白酒酒醅中乙醇含量的標準曲線。結果顯示，該方法在既定的濃度范圍內具有良好的線性關系（R2＞0.996），檢出限（3 S/N）為0.0027 mL/100mL。相關參數見表2。

表2 乙醇定量方法的線性和檢測限

按照酒醅預處理方法，于酒醅中分別添加不同濃度水平（0.5 %vol、1.5 %vol、2.5 %vol）的乙醇標準樣品，進行加標回收實驗。計算該方法的回收率和相對標準偏差（RSD），結果見表3。結果表明，該方法具有較高準確性和回收率，滿足快速測定白酒酒醅中乙醇含量的要求。

2.3 內標法和外標法連續多次進樣結果分析

頂空進樣是揮發性組分分析特有的進樣方式，在外部平衡條件不改變的情況下，每一次進樣，固定空間內的平衡體系中都伴隨一定量目標物的損失；且體系將在每一次進樣前重新形成新的平衡狀態。本研究參考林琳等[9]開發的HS-GC-MS 測定酒醅中乙醇含量的試驗方法，進一步加以優化，采用穩定性更高的內標法，消除連續進樣揮發系數不一致造成的結果不穩定現象；而且本方法采用SIM采集模式，更加精確，排除了出峰時間內其他物質的干擾。采用特征離子定量，分別對同一樣品連續6 次采樣分析，比對內標法和外標法的穩定性，其結果如圖2所示。

隨著樣品進樣次數的增加，外標法定量結果呈逐漸減少趨勢。內標法定量由于分別測定目標物與內標物特征離子的峰面積及相對校正因子，很好地解決了頂空重現性差的問題，內標物與乙醇在體系內形成比較穩定的平衡關系，其結果更加穩定準確，充分顯示了內標法特征離子定量的優越性。

2.4 SHS-GC-MS內標法與傳統蒸餾法比較分析

實驗采用上述SHS-GC-MS 內標法與傳統蒸餾法進行樣品檢測對比分析。據《白酒生產技術全書》中出池酒醅中乙醇含量測定方法：稱取100 g 酒醅于500 mL 蒸餾燒瓶中，加水200 mL 進行蒸餾，得餾出液100 mL，攪拌均勻，采用酒精計測定其酒精度，查表換算得出20 ℃時乙醇體積分數，單位為“%vol”。

由表4 分析比較可得，SHS-GC-MS 內標法與傳統蒸餾法相比，其準確性和靈敏度更優。綜合分析，傳統蒸餾法易受溫度、濕度等環境因素的影響，而SHS-GC-MS 內標法前處理簡單，干擾組分少，分析時間短，檢測數值穩定、準確、可靠，滿足白酒酒醅中乙醇含量的測定要求。

3 結論

采用SHS-GC-MS 建立了內標法測定白酒酒醅中乙醇含量的方法，并對方法預處理進行選擇、分析條件參數進行了優化，使得該方法具有很好的線性回歸和回收率。與傳統蒸餾法相比，本方法更為安全、快速、準確；與外標法相比，內標法由于其方法的優越性，可實現多次連續進樣，重現性好，靈敏度高，數據更加穩定。綜合分析，此法簡便、快捷、精準，適用于白酒酒醅中乙醇含量的快速測定。

表4 SHS-GC-MS內標法與蒸餾法的比較