兒童難治性支原體肺炎感染診治中MP-DNA載量及耐藥檢測的意義分析

鄭玥 劉秀芬 劉朝陽

肺炎支原體[1](Myoplasma pneumoniae，MP)是一種介于細菌與病毒之間的微生物，不僅是兒童呼吸道感染常見的病原體之一，也是社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP)中常見的病原體，其感染途徑主要通過患者的口、鼻分泌物經過空氣的傳播，引起呼吸道各個部位的感染。據有關文獻報道，MP全球感染率達到了9.6%～66.7%[2]，并且有逐年遞增的趨勢，其發病與季節無關，在人口密集的地方，MP的發病率更高，在家庭成員中也能夠相互傳染。近幾年隨著對MP感染的研究越來越多，MP是MPP的病原體，有研究學者發現，2007年肺炎支原體肺炎(Myoplasma pneumoniae pneumonia，MPP)的發生率是1999年的10倍，并有上升趨勢[3]。而近幾年關于難治性肺炎支原體肺炎(refractory Mycoplasma Pneumoniae pneumonia，RMPP)的發病率上升趨勢明顯。RMPP是經過抗生素治療后，病情仍然得不到控制。肺炎支原體感染可以造成呼吸道感染，也能引起急性重癥肺炎并伴有其他嚴重的并發癥，心肌炎、腦膜炎、溶血性貧血等，嚴重威脅兒童的生命健康。因此，盡早檢測出病原體對患者的治療和預后康復具有很大的意義。但是根據臨床研究，支原體肺炎發病不明顯，其發病癥狀、體征以及胸部X線缺乏特異性，確診需要經過病原學檢查。目前臨床上常用的檢測方法有MP培養分離、MP-IgM檢測、血清學等方法，MP培養分離因為需要特殊的培養基、培養時間較長、實驗操作繁瑣，檢出率不高等缺點，臨床上應用較少；而MP-IgM檢測因為容易受到病程、免疫狀態以及抗體出現和轉化的時間等影響，且在MP感染的早期診斷上性能不足，容易出現假陰性的結果；血清學方法主要通過檢測出IgM抗體或雙份血清IgG抗體滴度的增高作為感染的指標，由于IgG抗體與機體免疫狀態有關，嬰幼兒大都免疫力低下，一般檢測不出抗體，且靈敏度較低[4]。目前臨床普遍采用的實時熒光PCR技術主要用于進行感染的早期診斷，檢測過程簡單，只需要MP-DNA少量片段，通過PCR技術進行擴增就可以進行檢測，不受病程的影響，且靈敏度及特異性高。因此，本研究通過檢測肺炎支原體MP-DNA以及耐藥性檢測，為早期診斷治療，縮短病程，同時為新型抗生素以及疫苗的研發提供依據。

資料與方法

一、一般資料

選擇我院2016年12月至2017年12月兒科確診肺炎支原體肺炎(MPP)的患兒206例，根據臨床特征以及治療的效果，分為普通支原體肺炎組(普通組)100例，難治性支原體肺炎(難治組)106例，普通組，男/女：56/44例，年齡(4.92±1.73)歲：病程(17.52±6.78)d，難治組，男/女：50/56例，年齡(4.84±1.52)歲：病程(16.85±7.13)d。兩組一般資料比較無顯著差異(P>0.05)(見表1)。所有患者均簽署知情同意書。

表1 兩組患者的一般資料比較

1 納入標準 普通組：均確診為支原體肺炎，且無其他細菌感染；存在呼吸道感染癥狀，以發熱、干咳為主；胸部X片表現為點狀或小斑片狀浸潤影；體征不明顯，有呼吸音低，干濕啰音；入院前未接受其他治療、沒有應用抗生素[5-7]。難治組：應用大環內脂類抗生素7 d后，臨床以及影像學表現存在無好轉或惡化。

2 排除標準 存在肺結核、哮喘等其他肺部疾病的患兒；有嚴重的肝、腎功能障礙的患兒；用藥過敏的患兒；合并其他急慢性感染、自身免疫疾病的患兒。

二、研究方法

1 標本采集方法 在患兒入院當天用生理鹽水漱口或清潔口腔，并在同一天進行分泌物的采集，用舌壓板輕壓舌部，以輕快的動作，迅速擦拭咽及兩側腭弓部的分泌物，將拭子插入試管中，并及時送檢，用于MP-DNA載量及耐藥突變位點檢測[8]。

2 檢測方法 MP-DNA載量應用PCR熒光探針法，試劑盒用肺炎支原體核酸檢測試劑盒(中山大學達安基因股份有限公司)，儀器用ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀。MP耐藥檢測應用熒光PCR法，試劑盒用肺炎支原體核酸及耐藥突變位點檢測試劑盒(江蘇默樂生物科技股份有限公司)，儀器用Stratagene MX 3000P實時熒光定量PCR儀，均嚴格按照試劑盒說明書進行操作[9]。

(1) MP-DNA載量檢測：對采集的標本，加滅菌生理鹽水1.5ml到無菌玻璃管，充分震蕩搖勻，擠干棉拭子，立即12000rpm離心5 min，去上清，沉淀加滅菌生理鹽水1ml混勻，12000rpm離心5 min，將處理后的樣品放入儀器樣品槽，按對應順序設置陰性質控品、陽性定量參考品以及未知標本，選中所有設置樣品孔，設置循環條件：93℃2 min，93℃45s→55℃60s→10個循環，93℃30s→55℃45s→30個循環，結果以Ct值顯示，反應結束時電腦自動分析結果，結果判定：Ct值=30，實驗結果為陰性；Ct值<30，實驗結果為陽性。

(2)MP耐藥檢測：采用聚合酶鏈式反應(PCR)結合Taqman熒光探針對人痰液樣本中肺炎支原體核酸及其耐藥突變位點進行檢測。針對P1基因保守設計引物檢測肺炎支原體，探針采用VIC熒光標記；針對23SrRNA基因突變位點設計引物探針檢測A2063G和A2064G突變，探針采用FAM熒光標記，人工合成一段序列作為試劑盒內標，該序列與已知物種的核苷酸序列無相似性，內標探針采用CY5熒光標記。強陽性質控品和弱陽性質控品，包含P1基因序列和23SrRNA A2063G發生突變的基因序列，質控品W包含23SrRNA 2063和2064位點均未發生突變的基因序列，不含P1基因序列。

三、觀察內容

比較兩組患兒MP-DNA檢測結果；對所有抗生素耐藥的患兒進行耐藥突變位點結果分析；比較兩組患兒臨床及實驗室特點；比較兩組MPP影像學以及并發癥；對難治性MPP臨床特點采用Logistic進行多因素回歸分析。

四、診斷標準

肺炎支原體診斷標準[10]：血清特異性IgM抗體明顯升高，或者急性期和恢復期雙份血清特異性IgG抗體比較有4倍以上的升高或者下降到原來的1/4。

難治性肺炎支原體診斷標準[10]：肺炎支原體肺炎經大環內脂素抗菌藥物進行正規治療7 d以上，臨床征象加重、且持續發熱、肺部影像學表現加重，表現為單側或雙側大葉高密度肺實變，或合并胸腔積液，彌漫性間質性肺浸潤。

五、統計學方法

結 果

一、兩組患兒MP-DNA檢測結果分析

難治組MP-DNA檢測出的陽性率顯著高于普通組χ2=7.192，P<0.001，陰性率顯著低于普通組(χ2=5.162，P<0.001)(見表2)。

表2 兩組患兒MP-DNA檢測結果分析[n(%)]

二、兩組患兒對不同抗生素藥敏情況分析

難治組患兒對不同抗生素耐藥性顯著高于普通組患兒的耐藥性(P<0.05)(見表3)。

表3 兩組患兒對不同抗生素藥敏情況分析[n(%)]

三、 所有患兒中抗生素耐藥患者的耐藥突變位點結果分析

2063位A→G突變對大環內脂類抗生素耐藥影響更大，60%以上產生大環內脂類藥物耐藥的病例均檢測出2063位點G突變。其中，紅霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、克拉霉素、克林霉素耐藥病例基因型分布的差異有統計學意義(P<0.05)；而乙酰螺旋霉素、左氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星病例基因型分布的差異沒有統計學意義(P>0.05)(見表4)。

表4 MP23S rRNA V區2063位基因型與抗生素耐藥性的關系[n(%)]

四、比較兩組患兒臨床及實驗室特點

難治組患兒高熱、肺外并發癥、CRP增高、大環內酯類藥物應用時間、血沉增高例數及乳酸脫氫酶顯著高于普通組(P<0.05)(見表5)。

表5 比較兩組患兒臨床及實驗室特點

五、比較兩組MPP影像學以及并發癥。

兩組病變發生在雙側、右上側的分布有顯著差異(P<0.05)；兩組肺內合并癥、肺不張及胸腔積液的發生率比較有顯著差異(P<0.05)(見表5)。

表6 比較兩組MPP影像學以及并發癥[n(%)]

討 論

近幾年隨著醫療水平的提升及各種實驗室檢測手段的改進，MPP的發病率具有明顯的上升趨勢，并且兒童RMPP的發病率也是逐年遞增。目前國內外對于兒童RMPP沒有統一的標準，認為其發病機制主要是抗生素耐藥、過度或者異常的炎癥反應、合并細菌及病毒感染等[11-12]。臨床上大多主要采用大環內酯類藥物進行治療，目前主要認為兒童RMPP由于大環內脂類藥物治療效果不敏感，發熱時間長，病程一般大于4周，臨床癥狀加重，病情進展變化快，常在短時間內就會表現為肺部大面積的受累，易合并肺外并發癥、肺不張、閉塞性支氣管炎等后遺癥，更有文獻研究表明[13]，兒童RMPP的C反應不斷增高，可能會引起嚴重的炎癥發應，治療難度相當大。嚴重危害兒童的健康，目前已成為臨床關注的熱點。

目前臨床上用于MP感染的診斷主要是血清學，通過雙份血清IgG抗體滴度的增高或是急性期檢測出IgM抗體進行確診，但是經過大量的研究顯示，在發病初期的前2周可能檢測不出抗體，不適于進行早期診斷，且嬰幼兒或免疫力低的患兒，其抗原刺激力差，容易產生假陰性的結果，其靈敏度較低，同時特異度低。越來越多的研究發現證明，MP的分離培養其操作繁瑣，支原體的培養生長緩慢，不適于臨床，可以通過對呼吸道分泌物進行PCR檢測，靈敏度高、不受病程的限制，可以用于MP感染的早期診斷[14]。難治性與普通性的MPP進行MP-DNA檢測的結果顯示，難治組檢測出的陽性率顯著高于普通組，陰性率顯著低于普通組，P<0.05，可見難治性MPP中陽性率更高。此外，有研究報道[13]MP的DNA載量會隨著病程進展，平均存在下降的趨勢，全部轉為陰性，其中低載量在感染中可能提示MP仍存在，因此MP-DNA載量對診斷意義更大。

β-內酰胺類是主要作用于細胞壁[15]的一類天然耐藥抗生素，由于MP沒有細胞壁結構，且兒童正處于生長發育階段，所以臨床上在對兒童MP感染中使用四環素以及喹諾酮類藥物很少。因此，大環內酯類藥物經常作為MP治療的首選藥物。本次研究中，難治性與普通性的藥敏結局情況結果顯示，難治組患兒耐藥性顯著高于普通組患兒的耐藥性。此外，有臨床數據顯示[16]，我國兒童分離出的MP臨床菌株對大環內脂類抗生素具有較高的耐藥性，且難治性MPP中的耐藥性例數普通高于普通性MPP的耐藥性例數，這與本研究結果相符合。大環內酯類抗生素結合于核糖體50S亞基的轉肽酶中心與肽輸出通道狹窄之間的部分，通過機械性阻塞通道而抑制肽的延伸，從而阻礙蛋白質的合成。基因點突變導致的靶點改變是肺炎支原體對大環內酯類耐藥的最重要原因。耐藥主要機制為藥物作用靶位23SrRNA基因突變導致結合位點突變，大多數為A2063G的點突變和A2064G點突變。既往文獻報道[2]的基因突變集中在23S rRNA V區2063或2064位點基因顛換或轉換，主要表現為A2063G、A2063C和A2064G發生點突變，以A2063G最為常見。A2063G 要引起14、15元環的高度耐藥， 2064 點突變引起16元環的高度耐藥。研究中我們在患兒對不同抗生素產生耐藥性的基礎上，進一步對此類所有產生耐藥的患兒進行抗生素耐藥突變位點結果分析，發現2063位A→G突變對大環內脂類抗生素耐藥影響更大，60%以上產生大環內脂類藥物耐藥的病例均檢測出2063位點G突變。2064位點基因型產生喹諾酮類藥物耐藥的例數占較少部分。而MP對大環內酯類抗生素的耐藥機制主要為核糖體50S亞單位23S rRNA結構域V區和Ⅱ區核苷酸序列改變，最終導致抗生素與核糖體的親和力下降，從而患兒產生耐藥，也有研究表明[17]，藥物的主動排外系統也可能導致MP產生耐藥，還有研究發現，核糖體蛋白L4、L22基因位點突變也會影響大環內脂類抗生素耐藥性的產生。

MP感染患兒的白細胞大多正常或者少數輕微增高，而CRP常有不同程度的增高[18]，利于與一般細菌性肺炎相鑒別。比較兩組患兒臨床及實驗室特點，結果顯示，難治組患兒高熱、肺外并發癥、CRP增高、大環內酯類藥物應用時間、血沉增高例數及乳酸脫氫酶顯著高于普通組，其中難治組患兒高熱的例數顯著增多，可以推測發熱為難治性MPP的一個危險因素，難治性CRP增高更顯著，提示難治性MPP引起嚴重的炎癥反應；且難治性與普通性MPP肺外并發癥均增高，可能的原因是與近年來臨床醫師對肺外并發癥的逐漸認識以及早期進行相關檢查有關，提示其可能成為難治性MPP的一個危險因素，而大環內酯類藥物應用時間長、血沉增高及乳酸脫氫酶升高均可以作為難治性MPP的預測指標[19]。而在兩組MPP影像學以及并發癥方面的結果顯示，兩組病變發生在雙側、右上側的分布有顯著差異；兩組肺內合并癥、肺不張及胸腔積液的發生率比較有顯著差異；主要因為MP感染時，病原體直接損害免疫應答致使肺部發生病變，進而導致影像學的變化多樣。本研究結果顯示，普通性MPP組主要以雙側病變為主，單側主要是以右側為主，下肺多于上肺，且主要以右下肺為主，與翟佳羽[20]等的研究結果一致；而難治組主要以單側病變為主，右側多于左側，上肺多于下肺，且肺內病變嚴重，很容易合并肺內合并癥或肺不張或胸腔積液。因此，合并肺內合并癥或肺不張或胸腔積液可能是難治性MPP的高危因素。

綜上，應用MP-DNA檢測以及耐藥基因的檢測對于難治性MPP早期診斷具有很大的意義，且有利于病情的轉歸及臨床用藥的使用(如藥物的使用方案、使用時間及劑量等)。