HIF-1α通過調控miR-544對A549肺癌細胞免疫逃逸及NCR1/NKP46通路的影響

彭文 范長玲 張浩

資料與方法

一、實驗細胞

肺癌A549細胞購自中國科學院上海細胞庫，凍存在本實驗室，復蘇后采用含有10%胎牛血清(FBS)及含100U/mL青霉素、鏈霉素的DMEM培養基置于37℃ 5%CO2培養箱中培養。

自然殺傷細胞NK-92MI購自中國科學院上海細胞庫，復蘇后采用含有10%FBS及200U/mL重組人白細胞介素-2(IL-2)的α-MEM培養基，在37℃ 5%CO2培養箱中培養。

二、試劑與儀器

10%FBS(貨號10270-106)及含雙抗的DMEM培養基(R8758)均購于Sigma公司；Lipofectamine 2000試劑盒(1668-027)購于美國Invitrogen公司；RIPA裂解液( P0013B)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PI511)、白介素-2(Interleukin-2，IL-2)(PI660)、腫瘤壞死因子-ɑ(Tumor necrosis factor-ɑ，TNF-ɑ)(PA038)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；CCK8檢測試劑盒(40203ES60)購自上海翊圣生物科技有限公司；實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測試劑盒(E237)購自日本Takara公司；HIF-1α(ab1)、自然細胞毒性受體1(Natural cytotoxicity receptor 1，NCR1)(ab214468)、NKP46(ab14823)抗體購自英國Abcam公司;GloMax熒光讀數器購自Promega公司；ABI7500PCR儀器購自于Applied Biosystems公司；Tetra垂直電泳儀、Gel Doc XR凝膠成像系統購于美國Bio-RAD公司；CytomicsTM FC 500流式細胞儀購于美國貝克曼庫爾特公司。

三、實驗方法

1 細胞轉染：實驗一：取培養至對數期A549細胞更換培養液為不含FBS培養液培養1h，參用Lipofectamine 2000轉染試劑盒將轉染試劑、陰性對照si-NC、si-HIF-1α 分別轉染至A549細胞，分為Control組、si-NC組、si-HIF-1α，每組設定6個重復孔，繼續培養6h更換為含有FBS的培養液培養48h。

實驗二：取培養至對數期A549細胞，接種不含FBS培養液培養1h，參照Lipofectamine 2000轉染試劑盒進行轉染，將轉染試劑、NC、miR-544 mimics轉染至A549細胞，命名Control組、si-NC組、miR-544 mimics組，每組設定6個重復孔，其它步驟與實驗一相同。

2 免疫印跡法檢測轉染后細胞中HIF-1α蛋白表達：收集1.3.1 轉染后細胞，添加RIPA裂解裂解細胞30 min提取總蛋白，經SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜上進行轉膜反應，BSA封閉后，用HIF-1α一抗孵育膜，4℃過夜后用HRP標記IgG二抗室溫下孵育膜2h，清洗后，經化學發光顯影后，于凝膠成像儀內采集圖像，并采用Image pro-plus軟件定量分析HIF-1α蛋白相對表達量。

3 細胞中IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平檢測： 收集1.3.1中A549細胞，密度調整為1×104個與NK-92MI細胞(1 ∶5)混勻后共接種96孔板，孵育72h后，收集上清，采用酶聯免疫吸附法檢測細胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平，具體參照試劑盒說明書進行操作。

4 CCK8法檢測NK-92MI細胞免疫殺傷率：以1.3.1中轉染/未轉染的A549細胞作為靶細胞，將NK-92MI細胞作為效應細胞，調節靶細胞密度為1×104個接種96孔板，以靶效比1：5將NK-92MI細胞、A549細胞混勻后于37℃共孵育72h后，每組設定6個重復孔，添加CCK-8試劑孵育4h，收集共培養上清，于490nm處檢測各組OD值。免疫殺傷率(%)=(NK-92MI細胞OD+A549細胞OD-共培養OD)/NK-92MI細胞OD×100%。

5 qRT-PCR檢測細胞中miR-544表達：應用TRIzol試劑提取細胞中總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，參照qRT-PCR試劑盒進行擴增反應，配制體系：0.5 μL上下游引物，2 μL cDNA，10 μL 2×SYBR Green Mix，7 μL ddH2O，總共20 μL，qRT-PCR反應條件: 95℃ 預變性30s，95℃ 15s，72℃ 15s，35個循環。以U6或β-actin作為內參，2-ΔΔCt算法定量分析miR-544和NCR1相對表達水平。

6 熒光素酶報告基因測定 分別用miR-544 mimic及陰性對照質粒與轉染HIF-1α-wt/HIF-1α-mut熒光素酶報告基因表達載體共轉染A549細胞系，48h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統進行分析，各組熒光酶活性變化情況，采用熒光讀數器定量評估各組熒光素酶活性。

7 流式細胞術檢測細胞中NKP46表達 以1.3.1中A549細胞密度調整為1×104個與NK-92MI細胞(1 ∶5)混勻后共接種96孔板孵育72 h后，收集上清，添加PMA、細胞因子阻斷劑BFA、Ionomycin繼續培養5h，收集細胞，洗滌后添加熒光素標記抗體NKP46，4℃避光孵育30 min，清洗細胞后，添加4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后，添加破膜緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀分析細胞中NKP46表變化情況。

四、統計學處理

結 果

一、轉染si-HIF-1α 后A549細胞中HIF-1α表達情況

與Control、si-NC組相比，si-HIF-1α 組A549細胞中HIF-1α表達顯著降低(P<0.05)(見圖1)。

圖1 免疫印跡法檢測細胞中HIF-1α表達

二、轉染si-HIF-1α 后對細胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平的影響

與Control、si-NC組相比，si-HIF-1α 組細胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平顯著升高(P<0.05)(見表1、2)。

表1 各組細胞HIF-1α蛋白表達比較

表2 各組細胞中IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平比較

三、轉染si-HIF-1α 后對肺癌細胞免疫殺傷率的影響

與Control、si-NC組相比，si-HIF-1α 組NK-92MI細胞對肺癌細胞免疫殺傷率顯著升高(P<0.05)(見表3)。

表3 si-HIF-1α轉染后各組細胞免疫殺傷率比較

四、轉染si-HIF-1α 后對細胞miR-544的影響

與Control、si-NC組相比，si-HIF-1α 組細胞miR-544表達顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 si-HIF-1α轉染后各組細胞miR-544表達比較

五、miR-544靶向HIF-1α促進肺癌細胞免疫逃逸

TargetScan鑒定HIF-1α、miR-544結合位點如圖2。在HIF-1α 3’UTR-Wt細胞中，與si- NC組(2.26±0.37)相比，miR-544 mimics組熒光素酶活性(1.06±0.09)降低，差異有統計學意義(P<0.05)。在HIF-1α 3’UTR-Mut的細胞中， si-NC組(1.08±0.13)與miR-544 mimis組(1.06±0.11)熒光素酶活性比較無顯著性(P>0.05)(見圖2)。

圖2 miR-544、HIF-1α靶向結合位點預測

六、轉染miR-544 mimics后細胞miR-544表達情況

與Control、NC組相比，miR-544 mimics組細胞miR-544表達顯著升高(P<0.05)(見表5)。

表5 各組細胞中細胞miR-544表達比較

七、轉染miR-544 mimics后對細胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平的影響

與Control、NC組相比，miR-544 mimics組細胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平顯著降低(P<0.05)(見表6)。

表6 各組細胞中細胞IFN-γ、IL-2、TNF-ɑ水平比較

八、轉染miR-544 mimics 后對肺癌細胞免疫殺傷率的影響

與Control、NC組相比，miR-544 mimics組NK-92MI細胞對肺癌細胞免疫殺傷率顯著降低(P<0.05)(見表7)。

表7 miR-544 mimics 轉染后肺癌細胞免疫殺傷率比較

九、轉染miR-544 mimics后對細胞NCR1/NKP46表達的影響

與Control、NC組相比，miR-544 mimics組細胞NCR1、NKP46表達顯著降低(P<0.05)(見表8)。

表8 各組細胞NCR1表達比較

十、miR-544靶向NCR1 促進肺癌細胞免疫逃逸

TargetScan預測NCR1、miR-544結合位點如4。在NCR1 3’UTR-Wt細胞中，與miR-544 NC組(2.35±0.29)相比，miR-544 mimics組熒光素酶活性(1.05±0.12)降低，差異有統計學意義(P<0.05)。在NCR1 3’UTR-Mut的細胞中，NC組(1.05±0.16)與miR-544 mimis組(1.06±0.08)熒光素酶活性比較無顯著性(P>0.05)(見圖3、4)。

圖3 細胞NCR1、NKP46檢測結果

圖4 miR-544、NCR1靶向結合位點預測

討 論

機體免疫系統中存在較多毒性細胞，如NK細胞、T細胞等，均能夠通過免疫監視，及時清理癌變細胞，然而一部分腫瘤細胞突變后，自身免疫原性喪失，逃過免疫系統進入平衡期，當兩者平衡被腫瘤細胞打破后，則會發生免疫逃逸。NK細胞作為體內重要的淋巴細胞之一，在天然免疫和獲得性免疫中發揮重要作用。研究發現NK細胞能夠通過自身細胞毒性進而發揮對腫瘤細胞的免疫殺傷作用，如在白血病、非霍奇金氏淋巴瘤、胃癌、肝癌等[6]。臨床研究發現非小細胞肺癌患者經治療后可升高NK細胞、T淋巴細胞亞群、免疫調節因子水平，進而提高患者的免疫功能[7]。基于以上研究推測提高NK細胞對肺癌細胞免疫殺傷作用，可能為降低肺癌細胞免疫逃逸的靶向治療途徑，因此研究肺癌細胞免疫逃逸機制對深入探究肺癌的發生機制具有重要的意義。

NCR1又稱NKP46，屬于NK細胞的主要激活受體，過往研究發現NK受體NKP46/NCR1發揮在控制腫瘤轉移中關鍵作用[15]。在前列腺癌中研究證實NKP46呈下調表達[16]。Picard等研究發現血液中NKP46+自然殺傷細胞具有潛在的調節特性，對非小細胞肺癌患者預后具有一定的預測價值[17]。受到低氧誘導后，NK細胞中HIF-1a表達水平升高，NKP46表達降低，且NK細胞殺傷腫瘤靶細胞的能力也降低[18]。Pan等在肝癌中研究發現過表達miR-544后可抑制NCR1/NKP46通路，促進免疫逃逸[19]。本研究發現過表達miR-544后細胞中NCR1、NKP46均降低，TargetScan預測發現，在NCR1 mRNA的3’-UTR中存在miR-544的靶位點，熒光素酶報告基因檢測證實，miR-544是靶向NCR1 的調節分子之一，提示miR-544可能通過靶向NCR1/NKP46進而促進肺癌細胞免疫逃逸。

綜上所述，HIF-1α可能通過調控miR-544靶向抑制NCR1/NKP46通路，進而降低A549細胞對NK細胞介導的細胞毒性敏感性，導致NK-92MI細胞的抗腫瘤免疫活性被抑制，從而抑制NK細胞對A549細胞的免疫清除，參與腫瘤細胞免疫逃逸過程。本研究也存在一定的缺陷，僅探究miR-544與下游NCR1/NKP46通路的關系，miR-544是否還可能通過其他途徑參與細胞免疫逃逸，還有待后續深入研究。