堅果表型性狀在核桃種質鑒定中的應用

李亞蘭，潘存德，陳 虹

(新疆農業大學 林學與園藝學院/新疆教育廳干旱區林業生態與產業技術重點試驗室，新疆 烏魯木齊 830052)

【研究意義】核桃(JuglansregiaL.)系胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans)多年生落葉喬木，又名胡桃，是世界重要的古老堅果樹種之一[1-2]。其堅果富含油脂、礦物質元素和維生素等，是一種具有極高營養、保健和藥用價值的食品[3-4]。新疆作為我國核桃的重要產區之一，不僅有野生核桃的種質資源分布，而且有千年以上悠久的栽培歷史[5-6]，在自然和人為的雙重作用下孕育了豐富的核桃種質資源。植物豐富的種質資源是種質挖掘利用、保護及其相關研究的物質基礎，而對其表型性狀的鑒定評價則是挖掘利用的前提和依據。同時表型性狀評價還是種質資源遺傳多樣性評價不可或缺一分，具有簡便直觀的優點，被廣泛應用于不同植物種質的分類鑒定和核心種質的構建[7-8]。其中，植物果實性狀是比較穩定的遺傳特征，在分類與鑒定中具有重要價值[9]。【前人研究進展】R語言因其開源性、可移植性、靈活性等優點，被越來越多的科研人員所喜愛和使用，目前主要用于生態學[10]、基因差異表達[11]、田間試驗數據的分析[12]等方面的工作，但鮮有研究者將其應用于種質分類、形態及遺傳變異的相關研究。為了提供核桃育種工作表型性狀選擇的標準[13-15]，目前已有不少學者基于核桃堅果表型性狀進行遺傳多樣性的研究，但未見利用R語言進行其遺傳多樣性研究的相關報道。【本研究切入點】本研究將R語言應用于核桃種質資源堅果表型性狀的調查與分析，旨在揭示能夠鑒定核桃種質資源的有效表型性狀指標。【擬解決的關鍵問題】為今后R語言應用于核桃遺傳多樣性研究提供新的數據分析方法，以期為今后采用形態學分析與分子標記技術相結合的方法挖掘優質核桃種質資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以新疆核桃產區南疆盆地和田、喀什、阿克蘇地區廣泛收集的52份人工栽培的鄉土核桃種質作為材料。其中，栽培品種42份，實生優良單株10份(表1)。

表1 供試核桃種質編號及名稱

1.2 試驗方法

1.2.1 堅果表型性狀測定方法 針對每一份供試種質，在果實成熟期其盛果期植株上隨機摘取成熟的果實10個，剝去外果皮得到的堅果晾干至恒重后測定其表型性狀。首先，參考《植物新品種特異性、一致性、穩定性測試指南—核桃屬》(GB/T26909-2011，2011)進行堅果表型質量性狀指標測定，其中包括14個多態性性狀指標，即：沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、果基形狀、果肩形狀、果頂突出程度、脊分布、脊寬度、脊突出程度、脊旁凹槽深度、核殼顏色、核仁顏色、隔膜質地和內褶壁特征。然后針對完成表型質量性狀指標測定后的每一份種質的堅果，進行堅果表型數量性狀指標測定。堅果表型數量性狀指標包括9個，即：單果重、出仁率、縱徑、橫徑、側徑、核殼厚度、核仁粗脂肪含量、核仁粗蛋白含量和果形指數。其中，核仁粗脂肪含量測定采用索氏提取法[16]，核仁粗蛋白含量測定采用凱氏定氮法[17]。

1.2.2 數據分析方法 對堅果表型多態型指標與數量性狀指標進行數據統計后，將其轉變為虛擬變量，構建缺失(0)或存在(1)二元型數據矩陣，從而產生由74個表型性狀(C1～C74)組成的原始矩陣(表2)。采用非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)對原始矩陣進行聚類分析，并對分類數量的穩定性進行銳度測試(10 000次迭代)，顯著性水平為α=0.05，以確定最優分類等級；對其進行熱圖分析，最后采用多元回歸樹(multivariate regression trees，MRT)方法構建多元回歸樹，對能夠區分供試種質的最少表型性狀進行量化。

表2 核桃堅果表型性狀觀測指標

利用Microsoft Excel 2016進行原始數據的整理和計算；利用R語言對數據進行統計分析并作圖。使用MULTIV v2.4軟件進行群銳度化測試[18](Test of group sharpness)。

2 結果與分析

2.1 堅果表型多樣性

從質量性狀統計情況來看，供試種質堅果表型涵蓋了堅果表型性狀指標觀測類型。從數量性狀來看，供試核桃種質也呈現多樣性(表3)：單果重(MN)的均值為15.95 g，變異系數為0.25，變異幅度為18.08～26.07 g；縱徑(NL)的均值為44.17 mm，變異系數為0.13，變異幅度為31.67～56.60 mm；橫徑(NW)的均值為35.81 mm，變異系數為0.09，變異幅度為30.02～42.36 mm；側徑(NH)的均值為38.19 mm，變異系數為0.23，變異幅度為31.24～47.71 mm；果形指數(INS)的均值為1.20，變異系數為0.11，變異幅度為0.96～1.47；殼厚(HT)的均值為1.45 mm，變異系數為0.23，變異幅度為0.61～2.06 mm；出仁率的均值為45.69 %，變異系數為0.13，變異幅度為36.72 %～69.10 %；粗脂肪含量(CFC)的均值為62.43 %，變異系數為0.10，變異幅度為45.89 %～75.05 %；粗蛋白含量(CPC)的均值為17.56 %，變異系數為0.15，變異幅度為12.36 %～23.64 %。變異系數最大的指標為NW，最大值為26.07 g，最小值為8.00 g。

表3 核桃種質數量性狀的變異分析

2.2 堅果表型聚類

基于供試核桃種質堅果表型進行聚類分析，以群銳度測試進行檢驗，結果發現可將其劃分為2個不同的組(圖1)：G1包括JR09、JR50、JR19、JR25、JR20、JR24、JR04、JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46、JR45、JR28、JR47、JR49、JR23、JR48、JR52、JR29、JR32、JR30、JR27、JR21、JR10、JR42、JR08和JR11共29份種質，其共同特征是單果重>15.0 g，側徑<35.78 mm；G2包括JR06、JR22、JR07、JR12、JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37、JR36、JR43、JR38、JR40、JR05、JR44、JR17、JR51、JR35、JR14、JR41、JR18和JR33共23份核桃種質，其共同特征是單果重<15.0 g，側徑>35.78 mm。

圖1 基于核桃堅果表型的聚類分析(UPGMA)

針對G1群體再次進行銳度測試，將其分為11個亞群：G1′(JR09、JR50)、G2′(JR19、JR25)、G3′(JR20、JR24)、G4′(JR04)、G5′(JR15、JR13、JR02、JR34、JR16、JR46)、G6′(JR45、JR28)、G7′(JR47、JR49、JR23、JR48)、G8′(JR52)、G9′(JR29)、G10′(JR32、JR30)、G11′(JR27、JR21、JR10、JR42、JR08、JR11)；針對G2群體再次進行銳度測試，將其分為10個亞群：G12′(JR06)、G13′(JR22)、G14′(JR07、JR22)、G15′(JR03、JR31、JR26、JR01、JR39、JR37)、G16′(JR36、JR43、JR38)、G17′(JR38、JR40)、G18′(JR05、JR44、JR17、JR51、JR35)、G19′(JR14)、G20′(JR41、JR18、JR33)。

2.3 熱圖

根據對52份種質的堅果表型性狀數據轉化的二元矩陣，應用R語言進行聚類熱圖分析，將表型性狀與種質分類結果直觀展示，熱圖中性狀缺失(0)用灰色表示，性狀存在(1)則用紅色表示(圖2)。聚類熱圖結果與UPGMA聚類分析結果一致，性狀缺失(0)或性狀存在(1)將結果分為兩大類。

從圖2可以看出，52份種質堅果表型性狀的分布共同集中的性狀分布于內褶壁退化(C46)、橫膈膜膜質(C44)、核仁黃色(C40)。G1群體中種質共同的堅果表型性狀主要分布于單果重>15.0 g(C48)和側徑<35.78 mm(C55)；G2群體中種質共同的堅果表型性狀主要分布于單果重8.0～15.0 g(C47)。同時表型性狀在不同種質間的存在獨特分布，單份種質中JR48與其他種質共有23個指標，其殼厚-厚殼(C64)性狀與其他種質明顯區分；JR38種質其沿縫合線縱切面三角形(C2)性狀與其他種質明顯區分；JR01種質其出仁率低(C65)性狀與其他種質明顯區分；JR52種質其內褶壁革質(C45)性狀與其他種質明顯區分。

圖2 基于核桃堅果表型性狀的聚類熱圖

2.4 多元回歸樹(MRT)

應用52份供試核桃種質核桃的74個堅果表型性狀指標構建多元回歸樹，按照殼厚-厚殼(C64)這一性狀為根節點開始劃分，最后生成52個終結點樹狀分支(圖3)。圖3中性狀存在(1)在右邊分支，性狀不存在(0)在左邊分支，其中沿縫合線縱切面圓形(C1)、沿縫合線縱切面卵圓形(C3)、垂直于縫合線縱切面卵圓形(C7)、垂直于縫合線縱切面橢圓形(C8)、橫切面圓形(C11)、脊分布上1/2(C25)、脊分布上2/3(C26)、脊分布貫通(C27)、單果重8.0～15.0 g(C47)、果形圓形(C58)、果形長圓(C59)、殼厚-紙皮(C61)、殼厚-薄殼(C62)、殼厚-厚殼(C64)、出仁率中(C66)共15個性狀指標能夠區分供試種質。即沿縫合線縱切面形狀(C1～C5)、垂直于縫合線縱切面形狀(C6～C10)、橫切面形狀(C11～C12)、脊分布(C25～C27)、單果重(C47～C48)、果形(C58～C60)、核殼厚度(C61～C64)、出仁率(C65～C68)是區分供試種質的重要性狀。

圖3 基于核桃堅果表型性狀的多元回歸樹

3 討 論

植物表型性狀為植物遺傳多樣性的最直接反映，除了是衡量其遺傳多樣性的重要途徑和關鍵指標[19]，還對揭示植物的基因型具有重要意義[20]，并對農林生產中品種選擇與育種工作有重要影響。此外，在某些情況下，植物表型性狀可以有效地進行園藝植物種質的鑒定與分類。如莖瘤芥(Brassicajunceavar.tumida)種質的菜葉形狀、肉質莖和肉瘤形狀[21]，紫蘇(Perillafrutescens)種質的真葉顏色、葉型等[22]表型性狀的差異均成為其鑒定分類的重要指標，明顯的表型性狀差異使得部分種質成為易于識別的特色種質。國內外在對核桃種質表型性狀所表征的遺傳多樣性研究中，普遍采用核桃堅果性狀指標，如巴基斯坦[23]、土耳其[24]、阿爾巴尼亞[25]等國鄉土核桃品種的表型多樣性分析。本研究中采用的26個堅果表型性狀均為國內外相關文獻中作為核桃種質分類的重要指標[26-27]，除此之外，本研究還將堅果品質性狀(核仁粗脂肪、粗蛋白含量)同樣作為種質鑒定的重要指標，對堅果表型質量性狀與數量性狀進行分析，結果發現供試種質具有豐富的表型多樣性。

聚類分析的實質是綜合考察大量性狀指標，利用多元統計分析將供試對象分到相對同質的群組中的一種數學方法，已在植物表型性狀的研究中獲得良好效果，如有學者利用不同番茄(Lycopersiconesculentum)種質表型性狀進行聚類找到性狀突出、具有利用價值的新材料[28]，同時許多表型性狀研究中所得聚類結果與傳統分類結果及分子標記分類結果一致，證明基于表型性狀的種質分類具有一定的遺傳特征[29-30]。但聚類分析側重于種質間關系差異的量化分析[31]，采用不同的聚類參數和聚類算法可能得到不同的分類結果，因此有學者提出群體銳度測試[32]來確定最佳的分類數量，這種方法已廣泛應用于不同植物分類研究工作中，如菊科植物花粉分類研究[33]，以及巴西學者對胡椒科不同植物的分類[34]，目前并未有報道將其運用于園藝作物品種的分類鑒定工作。本研究中堅果表型性狀聚類分析后的群體銳度測試得到明顯區分的兩個類群(G1、G2)，各類群中的種質具有相同的堅果性狀。即使進行第二次銳度測試，G5′(6份種質)、G7′(4份種質)、G11′(6份種質)、G15′(6份種質)、G18′(5份種質)仍然各自聚為一類，說明從堅果表型角度考慮，其親緣關系較近。此外，有少數種質間具有相同唯一性狀，但它們并未組成明顯的分類群體，其原因可能是聚類過程中更多考慮大部分種質共有的堅果性狀。

聚類熱圖是將數據的相似性與差異性利用顏色的梯度及相似程度直觀的表現出來的一種方法，廣泛應用于基因表達量與基因表達的趨勢研究中[35-36]，同時在遺傳多樣性研究中，被用于對聚類分析結果的驗證，直觀顯示供試種質間親緣關系遠近及物種多樣性信息[37-38]，而在表型多樣性研究中應用較少。本研究中將表型性狀的有無以熱圖的形式顯示，能夠直觀表達供試種質間形態分化關系及不同種質間具有共有性狀分布情況，為揭示種質鑒定中的重要表型性狀提供重要信息。熱圖顯示所有供試種質分為兩大類，其分析結果與UPGMA聚類分析結果一致。表型性狀在不同種質間的獨特分布，能夠顯示出堅果表型性狀對種質的區分情況，僅在少數種質中存在的表型性狀是區分種質的重要性狀。如沿縫合線縱切面三角形(C2)、內褶壁革質(C45)、殼厚-厚殼(C64)、出仁率低(C65)分別僅在JR38、JR52、JR48、JR01和4份種質中存在，因此認為核殼厚度、沿縫合線縱切面形狀、出仁率、內褶壁等性狀能夠成為鑒定這4份核桃種質的重要表型性狀指標。

多元回歸樹的構建會通過交叉驗證對分類結果進行剪枝處理，盡量避免樹過擬合的現象[39]，同時其構建過程，就是變量的選擇過程。因此將MRT方法應用于構建種質間相關關系，不僅能夠對其進行聚類，而且具有一定的預測功能[40-41]，在生態學領域應用較為廣泛，如對環境因子與多物種分布的相關關系研究中，對植物群落進行合理地數量分類[42]。還有在海底魚類群體生態學研究中，學者利用多元回歸樹量化環境對單一物種及海洋群落的影響[43]。本研究利用供試核桃種質堅果表型性狀構建回歸樹，從MRT分類樹狀圖中直觀看出堅果表型性狀與種質間的關系，C1、C3、C7、C8、C11、C25、C26、C27、C47、C58、C59、C61、C62、C64、C66共15個堅果表型性狀被用于構建回歸樹，說明其對于供試種質的區分與鑒定貢獻較大，而其余性質則因影響較小而未在回歸樹中出現。因此認為基于核桃種質表型性狀鑒定種質中，沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、脊分布、單果重、果形、核殼厚度、出仁率等性狀是種質鑒定中重要的指標性狀，這與以往的核桃種質表型性狀研究結果一致[44-45]。此外，在分析中果形-圓形(C58)、殼厚-薄殼(C62)、出仁率-中(C66)等性狀多次將供試種質分類，同樣說明核殼厚度、出仁率等性狀在核桃種質鑒定中的重要地位。

4 結 論

52份供試核桃種質堅果表型多樣性豐富，沿縫合線縱切面形狀、垂直于縫合線縱切面形狀、橫切面形狀、脊分布、單果重、果形、核殼厚度、出仁率等性狀是種質鑒定中重要的指標性狀，研究結果為核桃種質資源基礎理論研究與育種研究提供基礎資料。此外，本文首次將R語言應用于堅果表型性狀的聚類分析，熱圖分析及多元回歸樹建立，為今后R語言應用于核桃植物形態與遺傳變異研究提供新的數據分析方法。