羅氏沼蝦TRY基因生物信息學及其mRNA表達分析

姜建萍，袁 翔，邱慶慶，黃光華，楊秀榮，蔣和生，楊學明*，蔣欽楊*

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530004；2.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；3.廣西水產科學研究院，廣西 南寧 530021)

【研究意義】羅氏沼蝦在我國淡水養殖業中占據主導地位，但存在規格不均勻、個體小型化及產量低等問題，嚴重制約羅氏沼蝦產業的可持續發展，而亟需選育羅氏沼蝦優良新品種[1]。胰蛋白酶(TRY)基因是重要的生長性狀候選基因，隨著分子生物學技術的快速發展，挖掘水產動物重要經濟性狀的候選基因，探索其生長發育的分子調控機制，將常規育種與分子育種有效地結合起來，對提高水產動物數量性狀優良基因型選擇的準確性及加速育種進程至關重要[2-3]。因此，開展羅氏沼蝦TRY基因生物信息學分析及其mRNA表達情況研究，對深入探究TRY基因生物學功能和提高羅氏沼蝦產量具有重要意義。【前人研究進展】TRY是動物體內的主要消化酶類，主要通過組氨酸殘基、天冬氨酸殘基和絲氨酸殘基組成的催化三聯體結構發揮消化作用[3]。已有研究表明，羅非魚[5]、鱖魚[6]、烏鱧[7]及斑節對蝦[8]、中國對蝦、克式原螯蝦和日本對蝦[9]等多種水產動物的TRY基因已被克隆獲得，且眾多學者對克隆獲得的TRY基因相繼開展了生物信息學分析，主要包括氨基酸序列比對、系統發育進化樹分析、同源性分析、編碼蛋白理化性質和二級結構預測等[10-13]。關于TRY基因mRNA表達在水產動物方面的研究，李運東[8]發現斑節對蝦TRY基因在肝胰腺組織中顯著高表達，且在整個生長階段均有表達，但存在不同的表達模式和表達規律；馬誠[11]研究認為瓦氏黃顙魚TRY基因在其胰臟中表達最高，在肝臟中次之；李運東[8]研究發現，斑節對蝦TRY基因的2個SNP位點與頭胸甲長、頭胸甲寬、第一腹節長和第二腹節長呈顯著相關；Klein等[14-15]研究表明，TRY基因在凡納濱對蝦蛻皮過程中發揮重要作用。可見，TRY基因是重要的生長性狀候選基因。【本研究切入點】目前，針對羅氏沼蝦TRY基因生物信息學分析及其TRY基因mRNA表達的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】基于候選基因法，結合NCBI已公布的EST序列分析TRY基因生物學信息及其mRNA表達情況，為深入揭示TRY基因對羅氏沼蝦生長發育的調控作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場5月齡羅氏沼蝦為試驗材料(n=14，雌雄各半)，采集其腹部神經、胃、心臟、鰓、性腺、肝胰腺、肌肉和腸道共8個組織樣品，以及生長快速家系(FG)和生長慢速家系(SG)中體重和體長極端性狀的雌性羅氏沼蝦肌肉組織，分別置于液氮中保存備用。

TRY基因mRNA表達所用試劑：TRIzol、反轉錄試劑盒和Premix ExTaqTMⅡ均購自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；TaqPCR MasterMix購自Vazyme公司。

TRY基因生物信息學分析所用軟件：同源性比分析對使用MegAlign，系統發育進化樹分析使用Lasergene v8.0，蛋白理化性質分析使用Expasy-ProParam，親/疏水性預測分析使用ExPASy-ProtScale，二級結構預測分析使用MLRC。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

參照TaKaRa公司的TRIzol試劑盒操作流程提取樣品總RNA，RNA濃度及其完整性分別采用微量分光光度計Nanodrop 2000和1.0 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑說明進行反轉錄合成cDNA。

1.3 實時熒光定量PCR分析候選基因mRNA表達

根據GenBank已公布的羅氏沼蝦TRYEST序列，利用Primer 3.0和Oligo 7.0設計引物，以18S rRNA基因作為內參，引物序列見表1。實時熒光定量PCR反應體系20.0 μl：Premix ExTaqTMII 10.0 μl，cDNA 5.0 μl，上/下游引物各0.5 μl，RNase Free ddH2O 4.0 μl。擴增程序：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR擴增引物信息

2 結果與分析

2.1 羅氏沼蝦TRY基因生物信息學分析結果

2.1.1TRY基因同源性比較及系統進化樹構建 根據NCBI已公布的EST序列可知，羅氏沼蝦TRY基因編碼266個氨基酸。同源性比較結果(圖1)顯示，羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與刀額新對蝦(Metapenaeusensis)TRY氨基酸序列的同源性最高，與三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)TRY氨基酸序列的同源性最低。利用Lasergene v8.0構建羅氏沼蝦(AMQ98968.1)、凡納濱對蝦(AEZ68613.1)、中國對蝦(ACQ45454.1)、脊尾白蝦(ABQ02534.1)、眼斑龍蝦(ADB66713.1)、中華絨螯蟹(AKN46052.1)、三疣梭子蟹(AHJ81099.1)、刀額新對蝦(ABQ02531.1)和擬穴青蟹(AGO02163.1)的氨基酸序列系統發育進化樹，結果(圖2)顯示，羅氏沼蝦和刀額新對蝦的遺傳距離最近，與凡納濱對蝦的遺傳距離最遠，說明羅氏沼蝦與刀額新對蝦的親緣關系最近，與凡納濱對蝦的親緣關系最遠。

圖1 羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與其他水產動物TRY氨基酸序列的同源比對分析結果

圖2 基于TRY蛋白氨基酸序列相似性構建的系統發育進化樹

2.1.2 TRY蛋白理化性質和結構預測 經ProtParam在線預測分析得知羅氏沼蝦TRY蛋白的分子量為28.54 kD，理論等電點為4.44；甘氨酸(Gly)含量較高，占總氨基酸含量的11.7 %；帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)為32個，帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)為12個，不穩定系數為27.62，脂肪數為81.39，親水性平均值為0.027。羅氏沼蝦TRY蛋白親/疏水性預測分析結果如圖3所示，TRY蛋白具有一定的疏水性。TRY蛋白二級結構預測結果顯示，羅氏沼蝦TRY蛋白二級結構中α-螺旋占17.67 %，延伸鏈占21.05 %，無規則卷曲占61.28 %。

圖3 羅氏沼蝦TRY蛋白的親/疏水性預測分析結果

2.2 TRY基因的mRNA表達分析

2.2.1TRY基因的組織表達譜分析 從圖4可看出，TRY基因在雄性羅氏沼蝦組織中的表達量以肝胰腺最高，其次為胃、心臟、腸道、腹節神經、鰓、精巢和肌肉；在雌性羅氏沼蝦組織中的表達量也以肝胰腺最高，其次為腸道、卵巢、胃、腹節神經、心、肌肉和鰓。其中，在雄性個體胃、心臟和肝胰腺中的表達量極顯著(P<0.01，下同)或顯著(P<0.05)高于雌性個體，在性腺中的表達量極顯著低于雌性個體，在腹節神經、鰓、肌肉和腸道中的表達量差異不顯著(P>0.05)。初步推測TRY基因在羅氏沼蝦中可能存在性別表達特異性。

雄性和雌性羅氏沼蝦胃、心臟、性腺和肝胰腺圖柱上的**表示差異極顯著(P<0.01)，*表示差異顯著(P<0.05)

2.2.2TRY基因在不同生長速度家系個體的表達規律分析 以本研究課題組前期采集FG和SG中體重和體長極端表型雌性羅氏沼蝦的肌肉組織為試驗材料(n=8)，進一步探究TRY基因在不同生長速度個體中的表達規律，結果(表2)表明，FG中個體的體重、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹節長和腹節寬等表型值均極顯著大于SG中的個體。

表2 16尾FG和SG雌性羅氏沼蝦個體的表型值比較

實時熒光定量PCR分析結果(圖5)顯示，TRY基因在FG個體肌肉組織中的表達量極顯著高于在SG個體肌肉組織中的表達量，且在FG個體中的表達量是SG個體中表達量的7.63倍。說明TRY基因在羅氏沼蝦生長發育過程中發揮了重要作用。

羅氏沼蝦FG個體肌肉組織圖柱上的**表示差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

TRY屬絲氨酸蛋白酶家族，其主要功能是消化蛋白質食物和活化所有胰腺分泌的酶原[14-16]，主要作用于靶蛋白的精氨酸或賴氨酸羧基端的肽鍵[17]。相關研究表明，TRY作為重要的蛋白消化酶類，與小龍蝦能量供應和生長所需的氨基酸代謝相關[18]，且與體型呈正相關，能解釋體型大小68 %的遺傳變異[19]。在大西洋鮭魚中的研究發現，TRY顯著影響游離氨基酸的吸收與轉運，其蛋白消化速率和游離氨基酸吸收效率與肌肉中的蛋白合成速率呈正比[20]。以上研究均表明，TRY與水生動物的生長發育顯著相關。本研究選取TRY基因作為羅氏沼蝦生長性狀候選基因進行深入研究，并基于NCBI已公布的EST序列，對羅氏沼蝦TRY基因進行生物信息學分析，同源性比對結果和系統進化樹分析結果均顯示，羅氏沼蝦TRY氨基酸序列與刀額新對蝦的同源性最高，即羅氏沼蝦與刀額新對蝦的親緣關系最近。

蝦蟹類動物的TRY主要由肝胰腺分泌[21]，而肝胰腺作為蝦類的主要物質代謝器官，在各種消化酶類合成、分泌及營養物質吸收、消化和能量儲存等方面扮演重要角色[22]，是影響甲殼類動物生長的重要器官[23-24]。本研究發現，TRY基因在雌雄羅氏沼蝦肝胰腺組織中高表達，與李運東[8]對斑節對蝦的研究結果一致；TRY基因在雌性和雄性羅氏沼蝦個體的胃、心臟、肝胰腺和性腺中的表達水平存在極顯著或顯著差異，推測該基因可能存在性別表達特異性，與詹湉湉[25]、許麗惠等[26]研究認為TRY基因在黃羽肉雞各組織中廣泛表達且在雌、雄黃羽肉雞的胰腺組織中表達量最高及不同發育階段、不同組織的TRY基因均存在性別差異性的觀點吻合。

本研究結果表明，FG中個體的體重、體長、頭胸甲長、頭胸甲寬、腹節長和腹節寬等表型值均極顯著大于SG中的個體。TRY基因在FG個體肌肉組織中的表達極顯著高于SG個體，與前人研究認為斑節對蝦的TRY基因表達量在幼體和仔蝦期很低，但隨著幼體的發育表達量逐漸升高[8]、隨著黃顙魚的生長發育，TRY基因的表達逐漸升高[27-28]及隨著凡納濱對蝦幼體的不斷發育，其TRY活力逐漸升高[29]的觀點相似。因此證實，TRY基因在羅氏沼蝦生長發育過程中發揮了重要作用，推測TRY基因表達量高的FG個體，其TRY活性相應也較高，因而生長速率快，與Ueberschar[30]研究認為大西洋鮭的TRY活性與生長速率呈明顯正相關、TRY活性可作為衡量其生長速率重要指標的觀點一致，進一步提示TRY基因可能通過肝胰腺組織介導并調控羅氏沼蝦的生長發育。

4 結 論

羅氏沼蝦與刀額新對蝦的親緣關系最近；TRY基因在羅氏沼蝦各組織中廣泛表達，以在雌、雄羅氏沼蝦肝胰腺組織中表達量最高，且存在性別差異性；TRY基因在羅氏沼蝦生長發育過程中發揮了重要作用，可能正向調控羅氏沼蝦的生長發育。