預處理及復水對PEG脅迫下水稻抗氧化系統的影響

譚佳緣，單 羽，任曉寧，夏師慧，李雪梅

(沈陽師范大學 生命科學學院，遼寧 沈陽 110034)

【研究意義】干旱是造成干旱地區和半干旱地區農業生產減產的主要因素之一，對植物的存活能力，生長發育、生理代謝以及植株的生長分布均有非常重要的影響[1]。全球每年因為干旱而造成的糧食減產是不可估量的巨大損失。我國近年來，在大部地區的降水量也呈現出季節性差異較大的趨勢，因此對植物進行干旱脅迫及復水后恢復適應能力的研究具有非常重要的理論和實踐的意義。【前人研究進展】干旱脅迫會誘發植物發生氧化脅迫，氧化脅迫與活性氧的產生及清除的平衡受到破壞有關[2]。當植物處于逆境時，植物可以通過提高抗氧酶的活性和抗氧化物的含量的方式來提高對活性氧的清除能力，但隨著脅迫程度的加深，活性氧生成的速率超過植物的清除能力的時候，活性氧就會產生積累，進而會在植物的體內發生氧化脅迫[3]。植物在氧化脅迫的情況下會加劇膜脂過氧化的作用，而膜脂過氧化的產物MDA和活性氧會進一步對生物膜造成嚴重的傷害，會使膜的通透性增加，進而引發植物體一系列的生理反應失調，嚴重地會導致最終導致植物的死亡[4-5]。植物體內有效清除活性氧抵抗氧化脅迫的保護機制主要可以分為酶促反應和非酶促反應兩類。抗氧化保護酶系統包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶等。非酶類抗氧化劑包括抗壞血酸、谷胱甘肽、甘露醇和類黃酮等。一些研究表明，植物在面臨干旱脅迫時是主動的適應調節而不是被動承受傷害，正是對這種脅迫的不斷適應，才使植物在長期的進化過程中形成了比較完善復雜的抗氧化系統來清除活性氧[6]。植物在早期面臨干旱脅迫時由于主動的適應調節，會對這種抗性產生記憶，在后續進行復水實驗則可以進一步明確植物的這種機制。而根據不同的試驗材料、抗氧化酶種類、脅迫程度及時間的不同，由于單一的抗氧化酶或抗氧化物質已經不能抵抗水分脅迫及復水造成的傷害通常情況下，植物需要啟動整個抗氧化系統來抵抗水分脅迫及復水造成的傷害。所以，針對干旱脅迫與復水后植物體內需要多種抗氧化酶或抗氧化物質的共同參與才能有效的清除植物體內過量的活性氧的機制的研究具有重要意義。【本研究切入點】本研究采用10 %PEG對水稻幼苗進行預處理，檢測預處理和再次15 %PEG脅迫抗氧化酶及抗氧化物質的變化。【擬解決的關鍵問題】探討PEG 預處理能否通過影響水稻抗氧化系統來提高水稻對水分脅迫的抗性。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取顆粒飽滿的水稻種子，28 ℃恒溫浸種24 h后30 ℃催芽24 h，在塑料燒杯中使用Hoagland營養液于人工氣候箱(晝夜溫度：28 ℃/26 ℃；80 %相對濕度；光照/黑暗：16 h/8 h；光強3000 lx)中培養，培養6 d后將水稻幼苗分為4組。

對照組：在整個實驗期間使用完全營養液培養；未預處理組：完全營養液培養144 h，后期用15 % PEG進行水分脅迫處理72 h；預處理組：完全營養液培養72 h，再用10 % PEG進行水分預處理72 h，隨后用15 % PEG進行水分脅迫處理72 h。預處理-復水組：用10 % PEG進行水分預處理72 h，然后復水(用完全營養液培養)72 h，再用15 % PEG進行水分脅迫處理72 h。于15 % PEG脅迫處理的0、24和72 h取4種處理水稻葉片進行各種生理指標測定。每種處理重復3次。

1.2 測定方法

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氯化硝基四氮哇藍法(NBT)[7]；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法[8]；過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外分光光度法[9]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參考Nakano和Asada方法[10]；谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定參考Ma和Cheng方法[11]；參照盧少云等[12]的方法測定抗壞血酸(AsA)含量；參照Ellman[13 ]的方法測定谷胱甘肽(GsH)含量。

1.3 統計分析

采用Microsoft Excel和SPSS20.0結合，分別對各項生理指標進行LSD-單因素最小顯著性差異分析(Least-Significant Difference，One-Way ANOVA，P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片抗氧化酶活性的影響

在脅迫時間為0 h時，可以看出在4組水稻葉片中，預處理組和預處理-復水組的SOD活性高于對照組和未預處理組的(圖1)。在脅迫24、72 h，預處理組和預處理-復水組的SOD活性都較低于對照組和未預處理組。隨著脅迫時間的增加，對照組和未預處理組的SOD活性都表現出了逐漸增高的趨勢；而預處理組的SOD在脅迫時間增加的過程中，并未發生明顯的變化；預處理-復水組的SOD活性則發生了下降的趨勢并且在脅迫24 h時到達最低，隨后在脅迫時間達到72 h時有所上升。

a、b表示不同脅迫時間相同處理間的差異；A、B表示相同脅迫時間不同處理間的差異，下同

脅迫0 h時，4組的POD活性沒有明顯差異(圖2)；隨著脅迫時間的增加，未預處理組、預處理組、預處理-復水組的POD活性也隨之升高，且都在脅迫時間為72 h時達到最高；與對照組相比，未預處理組、預處理組、預處理-復水組3組的POD活性在進行脅迫之后都表現出了更高的趨勢；而未預處理組的POD活性相較于其他3組的POD活性則表現出了相對較高的趨勢。預處理-復水組與預處理組之間的活性差異則并不十分顯著且與對照組相比都有較高的活性。

圖2 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片POD活性的影響

在脅迫0 h時，各組的CAT活性之間的差異并不顯著(圖3)；當脅迫增加至24 h時，4組水稻葉片的CAT活性也都隨之升高，其中預處理-復水組升高的幅度最大，預處理組和未預處理組之間的活性差異并不十分顯著，但與對照組相比都存在較高的活性差異；當脅迫時逐漸增加至72 h時，對照組和未預處理組的CAT活性都呈現出了下降的趨勢，而預處理組的活性則繼續升高至最大，同時預處理-復水組的CAT活性也相較于脅迫24 h時的CAT活性有著略微提高。

圖3 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片CAT活性的影響

水稻葉片的APX活性在0 h時，4種處理組之間沒有明顯的活性差異(圖4)。在脅迫進行了24 h時，未預處理組、預處理組、預處理-復水組的APX活性都隨著脅迫時間的增加而上升并達到了最高點，其中預處理組APX活性的升高幅度是最大的，且與其他3組之間的差異較為明顯；而隨著脅迫時間的增加，在72 h時，4組水稻葉片的APX活性都下降到最低點，且4組之間的活性差異也并不顯著。

圖4 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片APX活性的影響

同樣，各組葉片GR活性的變化隨著脅迫時間的增加也呈現出了先升高后下降的趨勢(圖5)。在所記錄的3個脅迫時間點，預處理組與其他3組相比GR的活性都較強，而其他3組之間的活性差異則不顯著。在脅迫時間為24 h時，4組水稻葉片的GR活性都升高至最大，脅迫72 h時，活性有所下降，但與之前脅迫0 h時相比活性的差異也并不明顯。

圖5 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片GR活性的影響

2.2 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片抗氧化物質含量的影響

AsA廣泛存在于各種細胞器中，在葉綠體基質中積累濃度最高，可以清除植物體內產生的活性氧[19]。GsH是植物中重要的解毒劑，是植物體內重要的活性氧清除劑，可溶于水。抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GsH)循環是植物體內清除活性氧的重要途徑[20]。

隨脅迫時間延長，4組水稻葉片的AsA含量呈現出下降趨勢(圖6)。在脅迫0 h時，4組水稻葉片的AsA含量都處在較高的水平，且各組之間的含量差異也較不明顯；脅迫24 h時，預處理-復水組的含量下降趨勢較緩，并在脅迫72 h時下降到最低，而其他3組的AsA含量在24 h下降之后則并無更為顯著的下降。

圖6 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片AsA含量的影響

對照組和未預處理組在脅迫時間的增加的過程中GsH含量并沒發生明顯的變化(圖7)，且預處理組和預處理-復水組的GsH含量也始終高于對照組和未預處理組。預處理組的GsH含量在脅迫時間為0 h時最高，24 h時并無明顯變化且在72 h時有所下降；預處理-復水組的GsH活性則在脅迫時間增加到24 h時升高至最高，隨后則在脅迫時間增加到72 h時下降到最低。

圖7 預處理及復水對PEG脅迫下水稻葉片GsH含量的影響

3 討 論

植物抗氧化系統作用于清除植物體內過多的ROS[21]。本實驗中未預處理組的SOD、POD活性的提高表明水稻葉片在受到PEG脅迫后可以通過提高酶的活性來清除過多的ROS。已有研究表明，進行適當的預處理可以提高植物的抗性[22-23]。預處理組及預處理-復水組SOD活性無明顯變化而POD活性變化幅度小于未預處理組則可以證明這一種觀點，說明PEG預處理可以提高水稻葉片的抗性，而且經過復水的葉片仍然具備這種抗性。王兆等[24]在以巖生植物雅安紫云菜為實驗材料的研究中，也證明了經干旱預處理后的植物SOD和POD活性都會顯著增強。

植物體內各種抗氧化酶協調作用以清除ROS，當脅迫開始，ROS大量的產生，各組CAT、APX和GR活性提高以清除過多的ROS。預處理組與預處理-復水組CAT活性持續上升而未預處理組的CAT活性先上升后下降，說明經過預處理的水稻葉片對PEG脅迫的抗性會增強，梅映學等[25]在采用預處理在對水稻進行干旱鍛煉后，測定其抗氧化酶CAT活性顯著增強。預處理組在脅迫24 h時的 APX活性高于未預處理組，隨著脅迫時間的升高，可能是由于ROS的產生超出了酶的清除能力或者是ROS破壞了酶系統，導致各組APX和GR活性下降。

植物抗氧化系統對ROS的清除作用是通過抗氧化酶與抗氧化物質之間共同作用來實現的。預處理組的AsA與GsH含量在脅迫0 h時均高于對照組和未預處理組，說明經過了預處理的水稻葉片的AsA與GsH含量有所增強；預處理可以使抗氧化酶系統啟動防御機制。隨著脅迫時間的升高，一方面由于前期AsA與GsH含量的提高，另一方面也可能由于預處理使水稻葉片產生抗性，使得AsA與GsH的分解速度也放緩，因此雖然各組的AsA與GsH含量呈現下降趨勢，但預處理-復水組在脅迫時間為24 h 時的AsA與GsH含量均高于未預處理組，說明前期預處理可以提供水稻葉片的抗性同時復水后水稻對抗性產生記憶，再次受到脅迫后仍能緩解脅迫所帶開的危害。徐勝等[26]和王娟等[27]的實驗研究也證明預處理可以使緩解由脅迫造成的植物幼苗葉片AsA與GsH含量的下降。

前期的PEG預處理可以使水稻葉片抗氧化系統活性增強產生抗性，清除ROS，并且水稻葉片可以對抗性產生記憶，使其可以更好地應對隨后的干旱脅迫。對其他逆境脅迫的研究也表明PEG預處理可以增強植物抗性[28]。