氮素對枸杞甜菜堿及其代謝關鍵酶的影響

周佳瑞，劉根紅，鄭國琦

(寧夏大學，寧夏 銀川 750021)

【研究意義】枸杞(LyciumbarbarumL.)為茄科枸杞屬，多年生落葉灌木。作為栽培作物人工種植己有上千年歷史，主要分布在我國寧夏、新疆、青海等地[1]。寧夏作為枸杞的原產地，有500多年的栽培史。枸杞栽培主要與其有效成分有關，研究發現枸杞中甜菜堿有增強人體免疫力、抑制腫瘤生長等藥理作用[2]。甜菜堿是枸杞子中主要有效成分之一，屬季銨鹽類化合物[3]，于植物中廣泛存在。甜菜堿在枸杞植株細胞內以膽堿為底物，經膽堿單加氧酶(CMO)與甜菜堿醛脫氫酶(BADH)逐步催化氧化生成，即：膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿[4]，CMO是植物中特有的一種特殊加氧酶(oxygenase)，由于其活性測定較為困難，因此近年來才逐漸對其有較深入的了解[5]。這兩種酶均由單一核基因編碼并存于葉綠體基質內[6]，其活性在逆境脅迫時增強,光誘導下促進甜菜堿合成。【前人研究進展】寧夏作為枸杞道地栽培地，其產量與品質都是決定其商品性的重要因素。產量在多年栽培研究中，基本趨于穩定，近年來更多關注在其品質栽培。枸杞的品質與環境因子、栽培條件等密切相關。武蕾[7]研究認為高肥力顯著促進葉片生長，提高枸杞產量并顯著改善枸杞果實品質，果實中甜菜堿等成分含量均有不同程度的提高；張建青[8]等進行不同施肥水平對枸杞產量的影響，結果表明，優化純氮量，明顯提高枸杞鮮果產量；韓宏偉[9]等在北疆區研究不同施肥水平對成齡枸杞生長及產量的影響，結果表明適時追施 N、P、K 肥，能有效提高枸杞春秋梢生長量及產量等指標；明鶴等[10]研究認為枸杞采收時期不同，甜菜堿含量亦隨之發生變化。植物主要通過根系從土壤中吸收養分，肥料的施深不同，其效果發揮即不同，同時根系對養分的吸收和干物質積累等也會發生變化[11]。羅健航[12]等研究表明，水平施肥方法對枸杞干果產量無顯著的影響，但隨著施肥深度增加，枸杞干果產量亦隨之增加。綜上所述，大多研究多集中于栽培因子與甜菜堿及枸杞生長發育之間的關系，但對氮素不同施肥處理條件下枸杞甜菜堿及代謝關鍵酶的影響缺乏深入的研究。寧夏枸杞栽培影響其產量與品質的主要因子是灌水量與氮肥用量，灌水在寧夏基本是模式化灌溉，一年三水(第三次為冬灌水)，灌水量控制在200 m3/667m2。因此氮肥的施用就成為灌區枸杞產量與品質的主要限制栽培因素。氮素是枸杞需求量最大的養分元素，其施用量與施用方式很大程度影響枸杞次生物質含量變化，甜菜堿是枸杞主要次生物質之一，其含量變化與氮素有很大關系，但其施用量與施用方式如何影響其變化研究國內外研究還不深入。因此，開展不同施氮量及施氮方式對枸杞甜菜堿含量及代謝關鍵酶的影響，通過對枸杞生長期間對其果實及莖葉生長狀況、產量、甜菜堿含量及其代謝關鍵酶的指標測定，明確氮素對枸杞產量及品質的影響規律，對枸杞品質化栽培具有重要的理論支持。【本研究切入點】該研究至2017年開始，相繼做了2年，2017年主要開展氮素不同施量、不同施氮深度、不同氮基追比例單因子試驗，研究單因子水平條件下各因子水平對甜菜堿含量及關鍵代謝酶含量的影響，為明確三因子對枸杞甜菜堿及代謝關鍵酶之間的關系，2018年開展了氮素不同施氮水平、不同施氮深度、不同氮素基追比例的三因子復合試驗，明確氮素與枸杞甜菜堿含量及代謝關鍵酶間關系。【擬解決的關鍵問題】為進一步從蛋白水平分析氮素對枸杞甜菜堿及關鍵酶代謝關系奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗設在寧夏農墾南梁農場，該地區位于東經106°13′，北緯38°40′，海拔1090 m。屬典型的大陸性氣候，干旱少雨，年降雨量約250 mm，熱量充足，溫差大，無霜期短。土壤以鹽分較高的灌淤土為主，該地區種植枸杞總面積1000萬平方米。

1.2 試驗材料

供試材料選擇寧夏主栽品種：“寧杞1號”，該枸杞品種抗逆性較強。

1.3 試驗設計

試驗于2018年3-10月進行，設置三因素三水平，分別為氮肥施用深度A(0～20、20～40、40～60 cm)，基追比例B(3∶1、2∶1∶1、3∶2∶1)氮素施用量C(0、30、40、50 kg/666.7m2)27個處理，3次重復，共81個小區。各處理設18棵樹，株距 1 m，行距3 m，各小區面積56 m2。施肥時期以4月中旬開溝基施并灌水，5月底、6月初結合鋤草追肥 1 次，8月初結合中耕追肥 1 次，供試肥料為尿素(氮素含量46 %)，有機肥配施磷鉀肥作底肥，常規磷肥施量(純磷40 kg/666.7m2)，常規施鉀量(純鉀30 kg/666.7m2)，常規有機肥(氮素含量0.53%)施用量(基施腐熟有機肥3000 kg/666.7m2)、常規灌水量(200 m3/666.7m2)，其他田間管理同大田生產。

表1 供試土壤的基本理化性質

1.4 指標測定

甜菜堿含量：采用高效液相色譜法測定。甜菜堿醛脫氫酶、膽堿單加氧酶：比色法。參考梁崢[13]的方法提取BADH,按駱愛玲等[14]方法，采用BIO-RED MINI電泳系統測定BADH含量。產量測定：選取各小區中間區域的枸杞樣株20株，在果實成熟期，對觀測樣株單獨采摘測定質量。

1.5 數據分析

利用 Microsoft Excel 2010和SPSS19.0軟件對試驗數據進行整理與分析。

2 結果與分析

2.1 不同施氮處理對枸杞甜菜堿的影響

2.1.1 不同施氮深度對枸杞甜菜堿含量的影響 不同施氮深度對枸杞甜菜堿含量影響的差異較大，枸杞甜菜堿含量在3種不同施氮深度處理下均存在顯著性差異。由圖1可以看出，整個生長期內枸杞甜菜堿含量整體呈現先增加后降低的趨勢，在6月20日，枸杞甜菜堿含量達到最高值，此后下降，這可能與后期土壤氮素供應逐漸減少有關。在不同時期內，甜菜堿含量均在施氮深度為0～20 cm時最高，20～40 cm次之，在40～60 cm時含量最低，在6月20日甜菜堿含量達到最高時，A1處理下的甜菜堿含量比A2、A3兩處理分別高10 %、17.28 %。認為在施氮深度為0～20 cm時，有利于甜菜堿含量積累，且隨著施氮深度的增加，甜菜堿含量降低。這可能與枸杞地表層鹽分含量及當地長期施肥方式有關，該地區屬于典型鹽漬化土壤，鹽分運移對氮素的吸收有明顯影響；長期的傳統淺層施肥，使枸杞根系主要分布在0～30 cm，30 cm以下根系分布較少，因此氮肥施深后其當年吸收效果也不佳。

圖1 不同施氮深度枸杞甜菜堿含量

2.1.2 不同基追比例對枸杞甜菜堿含量的影響 由表2可以看出，不同基追比例對枸杞甜菜堿含量影響差異性不同。整個生長期內B1(3∶1)處理下枸杞甜菜堿含量與B2(2∶1∶1)處理間差異均不顯著，與B3(3∶2∶1)處理間果實生長前期有顯著性差異，生長后期則表現差異性不顯著。在7月20日至8月5日，枸杞甜菜堿含量在三處理間差異均不顯著。枸杞甜菜堿含量在果實生長前期表現為B1>B2>B3，在7月5日之后，則表現為B2>B1>B3。氮素是枸杞甜菜堿合成必需的大量元素之一，其施肥量與施肥方式直接影響其甜菜堿的合成，試驗表明氮肥前期適量多施，后期適量追施，對枸杞甜菜堿合成有利。

2.1.3 不同施氮水平對枸杞甜菜堿含量的影響 由圖3可以看出，不同施氮水平對枸杞甜菜堿含量影響不同。枸杞甜菜堿含量在生長期內均呈現先增長后下降的趨勢，且整體表現為C1>C2>C3>C4，甜菜堿含量在6月20日為最高值，C1處理分別較C2、C3、C4處理高2.67 %、7.69 %、10 %。在果實生長前期，枸杞甜菜堿含量在不施氮(C1)時與C3、C4兩處理有顯著性差異，與C2處理則無顯著性差異；而在果實生長后期，則與不同施氮水平間均表現差異性顯著,C3、C4兩處理在生長期內甜菜堿含量變化不顯著。分析發現在不施氮的情況下，甜菜堿的含量最高，而隨著施氮量的增加，甜菜堿含量反而減少。甜菜堿是一種滲透調節物質，很多研究認為枸杞在逆境脅迫下利于甜菜堿的累積，因此，低氮水平影響其氮素積累水平的主要是逆境條件與施氮量，在高氮水平下，影響甜菜堿積累的可能是其它逆境因子，這可能是導致在氮素施量相對較高水平下不利于甜菜堿累積的主要原因。

圖2 不同基追比例處理下枸杞甜菜堿含量

圖3 不同施氮水平枸杞甜菜堿含量

2.2 不同施氮處理對枸杞代謝相關酶含量的影響

2.2.1 不同施氮深度對枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量的影響 由表2可以看出，甜菜堿醛脫氫酶含量呈現先增加后降低的趨勢，在6月20日時含量最高，且在此時期內，A2(20～40 cm)處理下含量最高，比A1、A3處理分別高出28 %、62 %；膽堿單加氧酶含量前期增長至6月5日后呈現先降低后增長的趨勢，在7月20日后又開始降低。整個生長期內，不同施氮深度對枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量影響不同，除6月20日外，三處理間2種酶含量均差異性顯著且表現為A1>A2>A3。說明在施肥深度為0～20 cm時，對2種代謝酶含量影響最大。這可能與根系分布位置及表層鹽分含量有關。

表2 不同施氮深度處理枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量

2.2.2 不同基追比例對枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量的影響 由表3可以看出，甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量在不同基追比例下含量變化不同。整個生長時期內，甜菜堿醛脫氫酶含量表現為B1處理與B2、B3兩處理間有顯著性差異，B2與B3處理間無差異；膽堿單加氧酶含量則表現為B1處理與B3處理間差異顯著。除7月5日外，甜菜堿醛脫氫酶含量均在B1(3∶1)處理時最高，B2、B3間無差異，在6月20日，其含量達到峰值，B1處理較B2、B3處理分別高出43.16 %、44.68 %；膽堿單加氧酶含量除6月5日外，整體表現為B1(3∶1)處理下含量最高，B2(2∶1∶1)次之。說明氮肥前期多施，適量追施，利于兩種酶含量的積累。

表3 不同基追比例枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量

2.2.3 不同施氮水平對枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量的影響 由表4可以看出，枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量在不同施氮水平下差異性不同。甜菜堿及甜菜堿醛脫氫酶與膽堿單加氧酶含量在生長期內均呈現先增長后下降的趨勢，6月20日甜菜堿醛脫氫酶達到最高，C1(不施氮)處理為3.11 ng/100μg，較C2、C3、C4處理分別高出58 %、68 %、78 %。2種酶含量在整個生長期內整體表現為C1>C2>C3>C4，說明在不施氮的情況下，2種代謝酶的含量最高，隨著施氮量的增加，2種代謝酶含量反而減少。甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶在枸杞體內催化甜菜堿合成，其含量變化趨勢與甜菜堿含量變化趨勢相吻合，充分證實枸杞生長期間兩種酶對甜菜堿的生理調控作用。

表4 不同施氮水平枸杞甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量

2.3 不同施氮處理對枸杞產量的影響

由表5可以看出，不同施氮深度處理下，枸杞產量表現為A1>A2>A3，A3處理下枸杞產量顯著低于其它兩處理，分別比A1、A2低22.68 %、21.09 %，說明施肥深度在0～20 cm時于枸杞增產有利，這與枸杞根系分布位置及當地施肥方式有關；枸杞產量在不同基追比例下表現為B1與B2處理間無差異，而B3處理與另外兩處理間差異性顯著,在基追比為3∶1時枸杞產量最高；在不同施氮水平下，3種施氮水平下枸杞產量均大于不施氮(C1)處理，這說明合理的氮肥用量對于提高枸杞產量具有重要作用。其中又以C3處理下枸杞產量最高，C4處理下產量最低，認為施氮肥40 kg/667m2時，利于枸杞增產，而在施氮過量時則可能對果實的生長有抑制作用。

表5 不同施氮處理下枸杞產量

3 討 論

肥料的施用位置不同，肥料效果的發揮即不同，根系對養分的吸收和積累也會發生變化，從而影響作物產量及品質。試驗中氮肥施用深度為0～20 cm時，枸杞甜菜堿、甜菜堿醛脫氫酶、膽堿單加氧酶含量及產量最高。占玉芳等[16]在河西灌區研究枸杞根系分布，發現根系中的細根和粗根集中分布在20～40 cm土層，其生物量的水平分布亦隨著距離的增加呈指數性下降。而本試驗則發現，氮肥施用深度為0～20 cm時養分對植株貢獻最大，這可能與農民施肥方式有關，當地施肥方式為溝施，溝深約20 cm，養分常年分布于20 cm左右，影響該區域根系活力，提高植株吸收養分的速率，從而提高肥料利用率，提高枸杞果實品質，使果實中甜菜堿含量提高[17]。胥生榮[18]等也提出寧夏枸杞行間操作主要以淺耕為主,對30 cm以下土壤擾動較小,因而影響下層根系對養分的吸收。且隨著氮肥深度的增加，深層氮比淺層更易流失，不能被植物充分吸收[19]。同時由于試驗地位鹽堿地，鹽分多積聚于表層，在鹽脅迫的條件下，甜菜堿的含量與甜菜堿醛脫氫酶(BADH)活性均會增加[20]。

枸杞作為一種較喜肥作物，其在不同時期需肥量不同，合理的氮肥基追比例，可以提高其產量及品質。試驗發現，7月5日前，在基追比為3∶1時，枸杞甜菜堿含量最高，而在7月5日之后，則在基追比例為2∶1∶1時最高。說明不同時期施氮較高時甜菜堿含量也較高，這與孟鳳[21]等人研究一致。枸杞產量、甜菜堿醛脫氫酶與膽堿單加氧酶含量整體在基追比例為3∶1時含量最高，說明基肥多施有利于兩種酶的積累且利于枸杞增產。

試驗發現施氮肥可以顯著提高枸杞產量，這與劉敏[22]、李永梅[23]等研究結果類似。枸杞作為較喜肥作物，在一定范圍內增加施肥量即可增加其產量。本試驗中以C3處理下枸杞產量最高，認為施氮肥 40 kg/667m2時，利于枸杞增產。但枸杞甜菜堿含量及 2 種代謝酶含量則表現為不施氮處理高于施氮處理，武蕾等[24]通過盆栽試驗，認為不同土壤肥力配方施肥可以提高枸杞果實品質，使果實中甜菜堿含量提高；劉建文等[25]研究也認為土壤肥力高于甜菜堿積累有利。而本試驗結果與之不同，隨著施氮量增加，甜菜堿含量降低。可能是因為試驗地為鹽堿地，在鹽脅迫條件下，枸杞細胞內會累積大量甜菜堿，以維持細胞的正常膨壓，并參與穩定復雜蛋白質的高級結構，且適量施氮肥，對鹽脅迫也有一定的緩解作用[26]，因而甜菜堿含量隨施氮量增加逐步降低。

4 結 論

研究表明，枸杞甜菜堿、甜菜堿醛脫氫酶及膽堿單加氧酶含量與產量在施肥深度為0～20 cm 時最高，隨著施肥深度的增加而逐漸降低。隨著施氮量的增加，枸杞甜菜堿及 2 種酶的含量降低，而枸杞產量大幅增加，在40 kg/667m2達到最大值。枸杞產量、甜菜堿醛脫氫酶與膽堿單加氧酶含量整體在基追比例為3∶1時最高。因此，在本試驗條件下，施肥深度為0～20 cm，基追比例為3∶1利于甜菜堿及 2 種酶含量累積。得出以上結果，以期為枸杞品質化栽培提供理論參考。