廣西降香黃檀炭疽病菌的生物學特性分析

閃 瑤，廖旺姣，鄒東霞，吳耀軍，黃華艷，黃乃秀

(1.廣西國有高峰林場，廣西 南寧 530000；2.廣西壯族自治區林業科學研究院，廣西 南寧 530002)

【研究意義】降香黃檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)俗稱海南黃花梨，是目前廣西大力推廣種植的珍貴樹種，其心材是名貴家具和工藝品的優質材料，經濟價值極高。但大面積營造純林后病蟲發生為害較普遍，其中炭疽病危害會引起降香黃檀嚴重落葉，影響樹木正常生長[1-4]。蜘蛛蘭炭疽菌(Colletotrichumhymenocallidis)是降香黃檀炭疽病的一種新病原菌，目前對其生物學特性了解甚少。因此，分析降香黃檀炭疽病蜘蛛蘭炭疽菌的生物學特性，對監控由該菌引起的炭疽病發生流行動態和制定有效的防控策略具有重要意義。【前人研究進展】伍慧雄等[2]、梁遠楠[3]調查發現，炭疽病是危害廣東肇慶市降香黃檀的主要病害。董文統等[4]調查顯示，炭疽病是危害降香黃檀的主要病害。關于病原菌，桑利偉等[5]、董文統[6]研究表明，膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.]是海南省降香黃檀炭疽病的病原菌。吳奉奇[7]研究認為，暹羅刺盤孢(Colletotrichumsiamense)是廣東肇慶市降香黃檀炭疽病病原菌。在病害防治方面，董文統[6]開展海南省降香黃檀炭疽病的生物學特性和病害流行規律研究，發現丙環唑、氟硅唑和吡唑醚菌酯?代森3種藥劑室內毒力測定效果較好；章穎等[8]通過室內藥劑毒力測定，發現溴菌腈、吡唑醚菌酯和苯醚甲環唑對降香黃檀炭疽病菌菌絲生長的抑制效果較佳；陳彧等[9]從降香黃檀葉片中分離篩選出對炭疽病抑菌率較高的拮抗細菌Y23；周潔塵等[10]從13種海南省外來入侵植物中篩選出垂序商陸和勝紅薊2種對降香黃檀炭疽病菌起良好抑菌作用的植物。【本研究切入點】已有研究表明，炭疽病的病原菌在降香黃檀不同栽培生境存在差異[5-7]，本研究在廣西獲得的降香黃檀炭疽病病原菌與海南省和廣東省不同，但針對其生物學特性的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】分析影響降香黃檀炭疽病蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢及孢子萌發的溫度、pH、碳氮源和光照等因子，為降香黃檀炭疽病的監測及防治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

采集廣西崇左市林業科學研究所降香黃檀苗圃感染炭疽病的降香黃檀葉片，按常規組織分離獲得純培養，經單孢純化，依據柯赫氏法則測定其致病性，參考廖旺姣等的方法[11]采用形態特征和分子系統學鑒定后，保存至PCA斜面培養基，選擇性狀優良的HC01菌株作為供試菌株，移入PDA培養基[12]平板上培養(25 ℃) 6 d后供測試用。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度對菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響 將HC01菌株在PDA培養基上培養6 d，以內徑為6 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，接種到PDA平板中間，分別置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃溫度條件下暗培養，各溫度處理均設3個重復。接種6 d后以十字交叉法測量菌落直徑，于接種15 d后用血球計數板計算產孢量[13-14]。挑取蜘蛛蘭炭疽菌的分生孢子，將用PDB培養液[12]配制的孢子懸浮液(2.00×106個/mL)滴在凹面玻片上，分別置于上述9個溫度下保濕培養，6 h后鏡檢孢子萌發率，每處理6個重復，每重復檢查100個孢子。

1.2.2 濕度對分生孢子萌發的影響 參考廖旺姣等[14]的小容器空氣濕度調節法，將分生孢子液(濃度同1.2.1)涂抹于載玻片上，陰干后置于50 %～100 %范圍內的7種不同濕度干燥器中，每處理3個重復，室溫(25 ℃)下保濕6 h后鏡檢其孢子萌發率。

1.2.3 pH對菌絲生長的影響 配制PDB培養液，用1 mol/L HCl和NaOH將其調配為pH 2～12(間隔為1)的培養液，分別接入3塊直徑為6 mm的菌餅，3個重復，28 ℃、130 r/min振蕩培養，10 d后過濾收集菌絲，80 ℃烘干至恒重后，稱量菌絲干重。

1.2.4 碳和氮源對菌絲生長及產孢的影響 參考方中達[12]的方法，以Czapek為基礎培養基，分別用等質量的D-果糖等9種碳源置換蔗糖，配制成含不同碳源的培養基；用等質量的尿素等9種氮源置換硝酸鈉，配制成含不同氮源的培養基。挑取直徑為6 mm的菌餅接種至上述不同碳、氮源培養基平板中央，每處理3個重復，置于25 ℃恒溫下暗培養6 d后，按1.2.1方法測定菌落直徑和產孢量。

1.2.5 光照對菌絲生長及產孢的影響 設完全黑暗、連續光照、12 h光暗交替(8 W，燈皿距離20 cm) 3個光照條件，參考廖旺姣等[13]的方法，挑取直徑6 mm的菌餅接種于PDA平板中央，置于上述光照條件下25 ℃恒溫培養，培養6 d后按1.2.1方法測定菌落直徑和產孢量。

1.3 統計分析

試驗數據采用DPS 13.01進行整理，以Duncan's新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 溫度對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響

由表1可知，蜘蛛蘭炭疽菌的菌絲生長溫度范圍為10～35 ℃，溫度過低(5 ℃)或過高(40 ℃)菌絲不生長，28和30 ℃時菌絲生長最快，其次是25和35 ℃。方差分析結果顯示，30 ℃處理蜘蛛蘭炭疽菌的菌落直徑最大，其次為28 ℃處理，二者間無顯著差異(P>0.05，下同)，但均顯著大于其他溫度處理的菌落直徑(P<0.05，下同)，說明28～30 ℃較適蜘蛛蘭炭疽菌生長；蜘蛛蘭炭疽菌在10～35 ℃均能產生分生孢子，其中在28 ℃時產孢量最大，25 ℃次之，二者間差異不顯著，但均顯著大于其他溫度處理，說明25～28 ℃為較適宜蜘蛛蘭炭疽菌產孢的溫度；分生孢子在15～30 ℃均能萌發，其中在20～30 ℃萌發率均在89.33 %以上，而在28 ℃時萌發率最高，30 ℃時次之，二者間差異不顯著，但均顯著高于除25 ℃處理外的其他溫度處理，說明28～30 ℃為較適宜蜘蛛蘭炭疽菌萌發的溫度。綜上所述，最適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢及孢子萌發的溫度為28 ℃。

表1 不同溫度對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢及孢子萌發的影響

2.2 濕度對蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子萌發的影響

由表2可知，蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子在相對濕度100 %+水滴、相對濕度100 %和90 % 3個條件下可以萌發，在相對濕度50 %～85 %條件下不萌發。其中，以100 %+水滴條件下萌發效果最佳，保濕6 h的萌發率達93.00 %，在100 %濕度下的萌發率次之，保濕6 h的萌發率為79.83 %，在相對濕度為90 %時萌發率銳減，保濕6 h的萌發率僅0.67 %，且三者間差異顯著。

表2 不同濕度對蜘蛛蘭炭疽菌分生孢子萌發的影響

2.3 pH對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長的影響

從圖1可看出，蜘蛛蘭炭疽菌菌絲在pH 3～12范圍均能生長，其中最適生長的pH為5，在強酸性條件下(如pH為2時)菌絲不生長，pH大于6菌絲生長量逐漸減少，尤其是pH為12的強堿性條件下，菌絲生長量極少；差異顯著性分析結果表明，不同pH處理菌絲的生長量差異顯著。說明蜘蛛蘭炭疽菌在弱酸性條件下生長較好。

曲線上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 碳源對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長及產孢的影響

從圖2可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在供試的10種碳源培養基上均能生長，其中在D-果糖、蔗糖、D-木糖、甘露醇、D-山梨醇和可溶性淀粉培養基上生長較好，在25 ℃下培養6 d時的菌落直徑分別為86.16、85.63、85.31、84.97、84.53和84.30 mm，相互間差異不顯著，但均顯著大于其他碳源培養基處理；在葡萄糖碳源培養基上的菌落直徑也較大，為81.84 mm，顯著大于在阿拉伯樹膠粉、乳糖和D-麥芽糖3種碳源培養基上的菌落直徑；在D-麥芽糖碳源培養基上生長最差，菌落直徑僅為44.53 mm，顯著低于其他碳源培養基。從圖2還可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在蔗糖碳源培養基上的產孢量最多，為1.50×106個/mL，在D-麥芽糖碳源培養基上的產孢量最少，為0.83×106個/mL，在其余碳源培養基上的產孢量為1.00×106～1.33×106個/mL，但相互間差異不顯著。

不同菌落直徑和產孢量圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同

2.5 氮源對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長及產孢量的影響

從圖3可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在多種氮源培養基上均能生長，其中在有機氮源酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培養基上生長最好，25 ℃培養6 d時菌落直徑分別為84.81、83.54和82.23 mm，處理間差異不顯著；在硫酸銨培養基上菌絲生長最慢，菌落直徑僅24.97 mm，顯著小于其他氮源培養基的菌落直徑。從圖3還可看出，蜘蛛蘭炭疽菌在牛肉膏氮源培養基上的產孢量最大，達3.50×106個/mL，其次是硫酸銨培養基，產孢量達3.00×106個/mL，二者間差異不顯著，但均明顯大于其他氮源培養基，而在硝酸鈉和甘氨酸培養基上的產孢量最小，均為1.00×106個/ mL。可見，酵母粉和牛肉膏是更適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長和產孢的氮源。

2.6 光照對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長及產孢量的影響

由表3可知，蜘蛛蘭炭疽菌在完全黑暗、連續光照和12 h光暗交替處理中的菌落直徑分別為80.91、88.12和84.04 mm，相互間差異顯著，說明充足的光照能加速蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長；3種光照處理的產孢量分別為1.50×106、3.33×106和2.83×106個/mL，即連續光照處理的產孢量最大，12 h光暗交替處理次之，完全黑暗處理最小，且相互間差異顯著，說明充足的光照可促進蜘蛛蘭炭疽菌產生分生孢子。

表3 不同光照對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長及產孢的影響

3 討 論

本研究結果表明，蜘蛛蘭炭疽菌在10～35 ℃均能生長，當溫度超過35 ℃時菌絲生長減緩，產孢量和孢子萌發率急劇減少，當溫度達40 ℃時菌絲停止生長，而溫度為28～30 ℃時蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢量和孢子萌發率均較高，其中最適合蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長、產孢及孢子萌發的溫度為28 ℃，與董文統[6]報道海南降香黃檀炭疽病菌膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和鄭肖蘭等[15]報道瓊中綠橙炭疽病菌(C.gloeosporioides)最適生長溫度均為28 ℃的結果一致；分生孢子在飽和濕度且有水滴條件下萌發效果最佳，與廖旺姣等[14]研究發現降香黃檀苗圃或林間在4月溫濕度較低時開始發病，在5-8月溫濕度較高時病害迅速擴展至高峰期，9-10月連續晴天持續高溫病斑擴展緩慢或不擴展的實際情況相吻合。說明影響降香黃檀炭疽病發生和流行的主要因素是苗圃或林間的溫濕度，尤其是苗圃濕度高時，非常有利于炭疽病傳播和蔓延。

本研究中，蜘蛛蘭炭疽菌在pH 4～6范圍尤其在pH為5時生長良好，與廖旺姣等[14]對降香黃檀炭疽病另一種病原菌豆類炭疽菌(C.truncatum)的研究結果一致，也與生產上調查了解到偏酸性黃壤土發生降香黃檀炭疽病危害比pH較高壤土嚴重的結果相符。

本研究中，不同碳源對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長和產孢具有一定影響，其中以D-果糖、蔗糖和D-木糖等為碳源的菌絲生長較好，產孢量較大，與董文統[6]的研究結果相似；而蜘蛛蘭炭疽菌菌絲在D-麥芽糖培養基上生長最差，產孢量也最小，與朱英芝等[16]、王義勛等[17]報道的油茶炭疽病菌(C.gloeosporioides)生物學特性一致。在氮源利用方面，本研究中蜘蛛蘭炭疽菌菌在酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培養基上生長最好，與朱英芝等[16]的研究結果一致；在硫酸銨培養基上生長最差，即硫酸銨對蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長具有抑制作用，與江正君等[18]對漆樹炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究結果一致；蜘蛛蘭炭疽菌在牛肉膏培養基上產孢量最大，說明牛肉膏氮源有利于蜘蛛蘭炭疽菌產孢，與王義勛等[17]對油茶炭疽病病原菌、范曉龍等[19]對南方紅豆杉膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的研究結果一致。本研究還發現，光照既可促進蜘蛛蘭炭疽菌菌絲生長，也可促進產孢，與孔瓊等[20]對枇杷炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究結果一致。

4 結 論

降香黃檀蜘蛛蘭炭疽菌的菌絲生長和產孢受溫度、pH、碳氮源和光照影響明顯，適宜的高溫和高濕有利于其病原菌分生孢子萌發。因此，生產上可根據該菌的生物學特性進行有效防控。