光合細菌與硅肥對油菜及土壤環境的影響

符慧娟，李星月，李其勇，朱從樺，向運佳，張 鴻

(1.四川省農業科學院植物保護研究所/農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066；2.四川省農業科學院，四川 成都 610066)

【研究意義】油菜是我國重要的油料作物之一[1]。四川作為我國油菜的主產區和優勢區，隨著長江中下游地區油菜播種面積的減少，四川油菜種植優勢更加凸顯。近年來，為追求高產量和高收益，農民在種植過程中盲目過量的施加肥料，造成土壤酸化嚴重、土傳病害加劇，因此，既要保證油菜免遭嚴重病蟲害，還要穩定油菜原有的品質和產量顯得尤為重要。光合細菌(Photosyntheticbacteria，PSB)屬于原核生物界薄壁菌門中的厭氧光合菌綱，它大量存在于自然水域的厭氧層上部，是一類以光能和低級有機物作為能源來源進行不放氧光合作用的微生物，它可以產生促進生長因子進而提高土壤肥力，加強植物光合作用，并且光合細菌菌體內含有多種維生素、豐富的蛋白質和氨基酸、輔酶Q10等多種生理活性物質，無毒、安全[2-3]?！厩叭搜芯窟M展】當前，光合細菌的研究主要集中在有機廢水的處理、動物飼養領域、光合細菌制氫及光合細菌生產高性價比有機物四方面[4-7]。除此之外，光合細菌對土壤的生物固氮能力有巨大的作用，它與其他固氮菌的共存可大大提高土壤肥力，作為底肥及葉面肥時可改善土壤板結、鹽化等問題，幫助植物根系發育[8]。在植物抗性和農藥殘留、病毒等各種病原物產生有效抗性，可在一定程度上起到植物抗病害作用，另外，它還可以通過氧化或降解殘留在土壤中的農藥、硫化氫及胺類等有毒化合物，減少有害物質在土壤中的沉淀累積，對土壤起一定解毒作用，避免或降低農作物中有害物質的積累，保證農副產品的安全[9-10]。硅肥是一種新型肥料，它能夠為植物提供其需要的有益元素，對油菜的農藝性狀等也存在較大的影響，能顯著提高油菜產量和理論產油量[11]?！颈狙芯壳腥朦c】近些年來，領域內各學者對光合細菌持續保持著一定研究熱度，而針對硅肥與光合細菌分別及混合施用對作物產量等影響的效果對比研究較少，本研究設置硅肥和光合細菌組合施用，通過比較分析硅肥和光合細菌對油菜的土壤養分、土壤酶活性、油菜植株性狀和油菜根腫病發病率的影響，運用Illumina高通量測序技術研究光合細菌處理下油菜根際土壤的真菌群落結構，探討光合細菌對油菜根際土壤的真菌群落結構的影響?！緮M解決的關鍵問題】為改善油菜土壤環境、提高油菜品質與產量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗概況

供試油菜品種為四川的油菜主栽品種川油36號。供試光合細菌為紅假單胞菌屬Rhodopseudomonasspp.，濃度為≥30億cfu/mL；供試硅肥為邁樂土壤調理劑(SiO2≥ 20 %)，由山西邁樂肥業有限責任公司提供。試驗地前作夏玉米，肥力中等，土壤類型為紫色土，土壤有機質含量為1.63 %，堿解氮為25.44 mg·kg-1，有效磷為6.78 mg·kg-1，速效鉀為86.64 mg·kg-1。

1.2 試驗方法

試驗于2017-2018年在四川省廣漢市進行，采用單因素隨機區組試驗設計，3次重復。試驗設置3個處理和一個空白對照處理，其中，GB為施用240 L·hm-2光合細菌處理，Si為施用600 kg·hm-2硅肥處理，GB+Si為施用240 L·hm-2光合細菌、600 kg·hm-2硅肥的混合處理，CK為未施用硅肥和光合細菌的空白對照處理，底肥采用15∶15∶15的氮磷鉀復合肥一次性施用，平均施用量為750 kg·hm-2。

播種期9月29日，采用直播方式，試驗密度為12萬株·hm-2，每小區24 m2(4 m×6 m)，小區間隔0.5 m，撬窩點播，行距20 cm，窩距20 cm。試驗區四周設寬1 m走道，走道外圍設有保護行。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤養分測定 油菜播種未施用底肥前，采用五點取樣法對試驗田耕作層進行取樣，測定全氮、堿解氮、硝態氮、銨態氮、有效磷、速效鉀、有機質含量。全氮用微量凱氏定氮法；有機質用重鉻酸鉀容量法；堿解氮用堿解擴散法；銨態氮用2 mol·L-1KCl浸提-靛酚藍比色法；硝態氮用酚二磺酸比色法；有效磷用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀用1 mol·L-1NH4OAc浸提-火焰光度法。

于油菜成熟期，采用五點取樣法對試驗區耕作層進行取樣，測定土壤pH值、土壤有機質和土壤堿解氮，土壤pH值用PHS-29A型酸度計(上海第二儀器廠生產)測定，水∶土=2.5∶1。

1.3.2 土壤酶活測定 采用高錳酸鉀滴定法測定土壤過氧化氫酶活性、3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性、利用靛酚藍比色法測定脲酶水解尿素產生的NH3-N含量確定土壤脲酶活性、酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定、3,5-二硝基水楊酸比色法測定纖維素酶。

1.3.3 植物指標測定 經濟性狀及產量：到成熟期時，每小區取5株樣進行室內考種，考察項目包括有效分枝高度、株高、莖粗、有效分枝數、單株有效角果數、30角果粒數、千粒重、種子水分；每小區單打單收曬種測定實際籽粒產量。

1.3.4 土壤總DNA 的提取及16S rRNA基因的PCR 擴增土壤總DNA 基因組采用DNA 提取試劑盒進行提取。真菌菌群用ITS(Internal transcribed spacer)序列高通量測定，遵循Illumina測序儀文庫構建方法，以ITS3-4 為目標DNA區域，采用擴增引物為：ITS1：(5′-TCC GTT GGT GAA CCA GCG G-3′)，ITS4: (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′)。PCR結束后，PCR產物進行瓊脂糖電泳檢測。真菌PCR產物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產物，選用0.6倍的磁珠(AgencourtAMPure XP)處理，真菌PCR產物和其他擴增片段小于400 bp的PCR產物，選用0.8倍的磁珠處理。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1的等量混合后測序。等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。將樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司在IlluminaMiSeq平臺進行高通量測序。

1.4 數據處理與統計分析

數據處理及相關分析采用Excel 2007 軟件進行，相關性分析采用SPSS17.0 軟件進行。

2 結果與分析

2.1 土壤pH值、堿解氮、有機質含量在光合細菌和硅肥互作下的表現

由圖1可以看出，通過對成熟期油菜土壤pH、土壤堿解氮和土壤有機質含量的測定發現，3種處理對油菜土壤pH值均無顯著影響，Si、GB+Si 2種處理僅能夠略微提高油菜根系土壤pH，但與對照相比沒有顯著差異；Si處理能夠顯著提高土壤堿解氮含量，而GB和GB+Si處理對土壤堿解氮含量無顯著影響；GB和GB+Si處理顯著增加土壤有機質含量。

CK：空白對照；GB：光合細菌240 L·hm-2；Si：硅肥600 kg·hm-2；GB+Si：光合細菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.2 土壤酶活力在光合細菌和硅肥互作下的表現

如圖2所示，通過對成熟期油菜的土壤過氧化氫酶(S-CAT)、土壤蔗糖酶(S-SC)、土壤脲酶(S-UE)、土壤酸性磷酸酶(S-ACP)和土壤纖維素酶(S-CL)的測定發現，各處理下的土壤酶活性差異明顯。GB、GB+Si處理對S-CAT活力有較優增益效果；S-SC和S-UE在GB+Si處理時活力得到了明顯升高，其中S-UE的活力值范圍趨近于760μg/d/g；S-ACP活力在GB和Si處理時有明顯提升，其中GB處理的影響更為顯著；Si單獨處理下，S-CL活力顯著提升，其余處理對S-CL活力的影響不顯著。

CK：空白對照，GB：光合細菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合細菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.3 油菜根腫病發生率在光合細菌和硅肥互作下的表現

各個處理的油菜根腫病發病率有顯著差異(圖3)，與對照相比，光合細菌單獨施用或同硅肥混合施用，都能有效降低油菜的根腫病發病率，而硅肥單獨使用，并沒有抑制根腫病發病率的作用。光合細菌有抑制根腫病病原菌侵染油菜根系的作用，而硅肥本身不能起到降低根腫病發病率的效果，只能說輔助改善油菜的根際土壤環境，提高植株的生理抗性。

CK：空白對照，GB：光合細菌240 L·hm-2，Si：硅肥600 kg·hm-2，GB+Si：光合細菌240 L·hm-2+硅肥600 kg·hm-2

2.4 油菜產量、經濟性狀在光合細菌和硅肥互作下的表現

本試驗共4個處理，分別測定了試驗區油菜的有效分枝高度、株高、莖粗、有效分枝數(一次)、有效分枝數(二次)、單株有效角果數、30角果粒數、千粒重、種子水分、小區產量十項指標，如表1所示，油菜有效分枝高度、株高、莖粗等指標在各個處理的影響均不顯著。在GB處理時，油菜植株單株有效角果數、小區實測產量兩項指標明顯高于空白對照及其他處理；Si處理下油菜植株株高、有效分枝數(二次)兩項指標明顯高于空白對照處理及其余處理，但小區實測產量優勢不突出；GB+Si處理下油菜植株30角果粒數、千粒重等指標相較于空白對照處理有明顯優勢，小區實測產量略高于CK對照處理。

表1 不同處理對油菜植株各指標的影響

2.5 光合細菌對油菜根際細菌群落在屬分類水平的影響

光合細菌的施入對油菜根際細菌群落在屬的分類水平上有顯著的影響(表2和圖4)，光合細菌提高了固氮菌-芽單胞菌屬Gemmatimonas、植物根際促生菌-假單胞菌屬Pseudomona的種群數量和比例，對油菜根際微生態環境有明顯的改良作用，不僅有利于根系的健康生長，并能利用生防菌優勢抑制土壤中的植物病原菌，減少油菜的土傳病害發病率。

CK為空白對照，GB為光合細菌處理240 L·hm-2

表2 光合細菌對油菜根際細菌群落在屬分類水平的影響

3 討 論

3.1 光合細菌和硅肥對油菜土壤肥力和酶活力的影響

光合細菌可以提高土壤肥力，降低土壤酸堿度[12]。本研究結果顯示，光合細菌處理下有機質含量得到顯著提高，堿解氮含量有微小的提升，但土壤pH降低；硅肥處理下，pH、有機質含量得到提高，堿解氮含量顯著升高；光合細菌和硅肥分別顯著提高了有機質和堿解氮含量，將其混合施用后，pH、堿解氮和有機質含量均得到提升，土壤肥力呈現了更綜合和全面的提升，說明光合細菌和硅肥搭配使用能夠有效促進相互之間作用的發揮。光合細菌還能產生很多有價值的有機物，如單細胞蛋白、類胡蘿卜素等[4]。同時，施用適量的光合菌肥數量可以較好的促進酶活，促進植物生長。有研究表明，復合菌劑處理促進了過氧化氫酶、脲酶、酸性磷酸酶、纖維素酶的活性得到升高[13]。本研究結果得出，S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP 4種酶活力在施用光合細菌后都有提升，其中S-CAT、S-ACP的酶活力呈現顯著增加；S-CAT、S-SC、S-UE、S-ACP、S-CL的酶活力在硅肥處理下均有所提高，但僅對S-CL的酶活力影響達到了顯著水平；光合細菌和硅肥混合施用處理下，S-CAT、S-SC、S-UE的酶活力比分別單獨施用光合細菌和硅肥的提升效果更佳，但在對S-ACP和S-CL的活力影響為負。

3.2 光合細菌和硅肥對油菜產量、經濟性狀的影響

有研究顯示，通過光合菌劑沾根或噴施處理，能夠促進水稻生長發育、促進水稻灌漿、增加稻米蛋白質含量、提升水稻品質[14]。在同基礎之下，采用光合細菌噴施之后顯著提高了蔬菜的產量[15]。本文通過研究光合細菌和硅肥耦合作用下對油菜產量、經濟性狀的影響，結果顯示，GB、Si、GB+Si處理下油菜千粒重和小區實測產量相較于空白對照處理有顯著優勢，種子水分含量小于CK處理，千粒重、種子水分、小區實測產量對油菜產油量存在影響，千粒重、小區實測產量與油菜產油量正相關，種子水分與油菜產油量負相關，因此GB處理下，油菜千粒重、種子水分、小區實測產量相較于其余處理呈顯著提高水平，油菜的產量及產油量都具有明顯優勢。

3.3 光合細菌和硅肥對油菜根腫病發生率的影響

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分[16]，光合細菌具有明顯抑制真菌增殖的作用，它通過提高放線菌數量抑制真菌增殖，改善土壤環境，使根系活力增強促進其對營養元素的吸收，減少土傳病害的發生。有研究表明，PSB發酵液中含有多種生理活性物質和微生物菌群，這些生理活性物質能夠激活植物細胞的活性，提高細胞的光合作用能力，微生物菌群可代謝生成多種酶和有機酸，促進土壤中有益菌的增加及各養分分解、改善土壤結構和土壤理化性質[17-19]。本研究結果顯示，光合細菌單獨或混合施用情況下，均能夠降顯著低油菜根腫病發病率，推測其原因：光合細菌通過提高有益菌的數量，調節土壤環境，有效改善油菜根際土壤菌群結構，降低油菜根腫病的發生幾率。

4 結 論

光合細菌和硅肥均對土壤養分、土壤酶活性及油菜的產量、經濟性狀等都產生了有益的影響，并有效減低了油菜根腫病的發病率，對油菜產量、產油量和根腫病抑制效果的影響由高到低排序為：光合細菌>光合細菌+硅肥>硅肥>空白對照。從土壤微生態角度出發，光合細菌促進了有益菌的生存和繁殖，提高了固氮菌、植物根際促生菌的數量，改善了油菜根際微生態環境、優化了根際土壤真菌群落結構。本試驗結果表明光合細菌與硅肥在增強油菜土壤肥力、抑制油菜土傳病害方面具有潛力，可以在油菜健身栽培與綠色生產中的進一步推廣應用。