霉酚酸對小反芻獸疫病毒復制的影響

張邵博，擺倩文，常秋燕，丁功濤*，皮爾·穆罕默德·阿卜杜勒

(1.西北民族大學生物醫學研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；3.馬來西亞國立大學工程與建筑環境學院，馬來西亞 雪蘭莪州 43600)

【研究意義】小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus，PPRV)屬于副黏病毒科、麻疹病毒屬，是小反芻獸疫(peste des petits ruminants，PPR)的致病原[1-2]。PPR是能引發包括野生動物在內的小反芻動物的一種急性、烈性、致死性、高度接觸性傳染病，在易感群體中，可高達90 %以上的致死率。主要表現為肺炎、糜爛致死性口炎、呼吸道炎、腸炎等癥狀[2-5]。【前人研究進展】2007年PPR在我國西藏阿里革吉縣首次出現[6]。2013年鄰國發生了PPR的大流行，并且蔓延到我國的許多省份[7-8]。2014年甘肅古浪縣PPR暴發疫情[9]。PPR作為Ⅰ類世界性動物疫病，影響范圍廣，危害大，給養殖業帶來巨大的經濟損失，影響我國的肉制品出口貿易。我國作為農業畜牧業出口大國，動物疫病防疫面臨著巨大的挑戰。利用現有的藥物防控PPRV是一種低成本高效益的解決方案。霉酚酸酯 (mycophenolatemofetil，MMF)是國內外廣泛應用于預防、治療移植器官急性排異反應的免疫抑制劑[10]。霉酚酸酯(MMF)是霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)的2-嗎啉代乙基酯類衍生物，MMF進入機體后迅速代謝為MPA而發揮免疫抑制作用[11]。MPA除了具有免疫抑制能力外，在體外還可有效的抑制多種DNA和RNA病毒，包括登革熱病毒[12]、西尼羅病毒[13]、黃熱病病毒[14]、基孔尼亞病毒[15]、乙肝病毒[16]和丙肝病毒[17]。MPA是次黃磷核苷酸脫氫酶(inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)的非競爭性抑制劑，尤其是IMPDH2亞型[18]。MPA通過抑制IMPDH的活性，阻斷細胞內鳥苷酸的合成，使得鳥苷池中GMP含量不足，從而抑制病毒復制?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用PPRV敏感細胞株Vero細胞來評價免疫抑制劑MPA在體外對PPRV復制的影響，并探討其可能的機制?！緮M解決的關鍵問題】以期為PPRV的研究與防控提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

毒株、細胞株：PPRV疫苗株-PPRV/Nigeria 75/1(新疆天康生物技術股份有限公司)；Vero細胞(CCTCC)。試劑及器材：M199培養基(北京賽澳美細胞技術有限公司)；新生牛血清(蘭州民海生物工程有限公司)；DMSO(Sigma-Aldrich)；TRIzolTMReagent(Invitrogen)，反轉錄試劑盒(Promega)；q-PCR試劑盒(Genecopoeia)；CCK-8(北京索萊寶科技有限公司)；霉酚酸(Sigma-Aldrich)；鳥苷酸Guanosine(Sigma-Aldrich)；酶標儀(Thermo)；q-PCR儀(Bio-Rad)。

1.2 試驗方法

1.2.1 MPA的細胞毒性實驗 將Vero細胞接種于含M199培養基(含3 %新生牛血清)的96孔板，接種密度3×104cells/mL，每孔100 μl，置5 % CO2、37 ℃的培養箱中培養；24 h后換含有不同濃度MPA的培養基(含1 %新生牛血清)，MPA作用終濃度分別為0、0.1、0.5、1和5 μmol/L，每種濃度5孔平行，以不含MPA孔為對照，繼續培養120 h；每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養2 h后，將96孔板置于酶標儀中，450 nm處測定光密度值，帶入公式viability=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100 %計算細胞活率，其中As為實驗孔吸光度(含細胞、培養基、CCK-8溶液和MPA)、Ac為對照孔吸光度(含細胞、培養基、CCK-8溶液、不含MPA)、Ab為空白孔吸光度(含培養基、CCK-8溶液、不含細胞和MPA)。該實驗獨立重復6次。

1.2.2 MPA對PPRV增殖的影響 MPA粉末在DMSO中溶解，濃度為1.5×10-2mol/L。將Vero細胞按照5 ×105cells/孔接種于6孔板中，M199培養基(含3 %新生牛血清)、5 %CO2、37 ℃培養箱中培養24 h；接種PPRV(MOI=1)感染細胞，培養1.5 h后，將培養基換成含1 %新生牛血清的M199培養基繼續培養，對照組不接種PPRV；24 h后棄上清培養基，每孔加入3 mL含不同濃度MPA的M199培養基(含1 %新生牛血清)，MPA作用終濃度分別為0、0.1、0.5、1和5 μmol/L，繼續培養5 d，每24 h觀察細胞生長情況；培養5 d后，一部分細胞培養板棄培養基，用1 mL的1×PBS清洗3遍，每孔加入500 μl TRIzol，冰上裂解10 min，收集細胞，置-80 ℃保存提取RNA備用；另一部分細胞培養板棄培養基，用1 mL的1×PBS清洗3遍，每孔加入1 mL 70 %乙醇固定2 min，去乙醇，加入1 mL的1×PBS，顯微鏡下觀察接毒后經各濃度MPA處理的Vero細胞生長狀況。該實驗獨立重復6次。

1.2.3 霉酚酸抑制PPRV增殖的動力學效應 將Vero細胞25×104cells/孔接種于12孔板，M199培養基(含3 %新生牛血清)、5 % CO2、37 ℃培養箱中培養24 h；接種PPRV(MOI=1)感染細胞，培養1.5 h后，將培養基換成含1 %新生牛血清的M199培養基繼續培養，對照組不接種PPRV；24 h后棄上清培養基，每孔加入2 mL最佳濃度的MPA培養基混液，繼續培養120 h，不經MPA處理組作為對照組，每24 h觀察細胞生長情況，分別收集0、24、48、72 、96和120 h的細胞。每孔加入500 μl TRIzol，冰上裂解10 min，-80 ℃保存提取RNA備用。該實驗獨立重復6次。

1.2.4 鳥苷酸的細胞毒性實驗 將鳥苷酸粉末在DMSO中溶解，濃度為1×105μg/mL。實驗方法同2.1。鳥苷酸終濃度為0，1，10，100 μg/mL，以不添加鳥苷酸組為對照組。

鳥苷酸對MPA的拮抗作用。將Vero細胞25×104cells/孔接種于12孔板中，M199培養基(含3 %新生牛血清)、5 %CO2、37 ℃培養箱中培養24 h；接種PPRV(MOI=1)感染細胞，培養1.5 h后，將培養基換成含1 %新生牛血清的M199培養基繼續培養，對照組不接種PPRV；24 h后棄上清培養基，每孔加入2 mL含不同濃度的鳥苷酸和最佳濃度的MPA混合液，鳥苷酸的終濃度分別為0、1、10和100 μg/mL，繼續培養120 h，每24 h觀察細胞生長情況；培養5d后，棄培養基，用1 mL的1×PBS清洗細胞3遍，每孔加入500 μl TRIzol，冰上裂解10 min，收集細胞，置-80 ℃保存提取RNA備用。該實驗獨立重復6次。

1.2.5 RNA的提取、反轉錄及q-PCR驗證 提取樣品總RNA，定量1 μg RNA為模板，兩步法反轉錄成cDNA并進行q-PCR，反應中所用的引物序列為：Vero-GAPDH-Forward：5’-TCTGGGTAAAGTGGATAT TGT-3’，Vero-GAPDH-Reverse：5’-TTCCAGTATGATTCCACC-3’；PPRV-H-Forward：5’-CTGAATACCAACATTGAG-3’， PPRV-H-Reverse：5’-GAGGAACTTAATCTTATCG-3’。q-PCR反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環，以猴源GAPDH為參照基因，采用2-ΔΔCT(ΔCTsample-ΔCTcontrol)公式對基因表達進行計算。

1.3 統計學分析

使用GraphPad Prism version8.01分析軟件采用未配對-非參數分析方法(Mann-Whitney test)對所得結果進行數據分析，結果用Mean±SD表示。*P﹤0.05; **P﹤0.01; ***P﹤0.001；ns：差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 MPA的細胞毒性實驗

不同濃度MPA處理細胞120 h后，如圖1所示，低濃度0～0.5 μmol/L的MPA對Vero細胞活性的影響無顯著差異，隨著MPA濃度的增加，5 μmol/L MPA對細胞活性的影響差異極顯著(P﹤0.001)。

圖1 霉酚酸對Vero細胞活性測定

2.2 不同濃度MPA對PPRV增殖的抑制

如圖2所示，不同濃度MPA處理的Vero細胞，在光學顯微鏡下顯示，MPA對PPRV的增殖呈藥物依賴濃度梯度抑制作用，1和5 μmol/L的MPA濃度細胞病灶明顯少于其他組；如圖3所示，q-PCR測定病毒的增殖情況，所得結果與圖2所示細胞水平結果相一致，0.1、0.5、1 μmol/L濃度組均顯著抑制PPRV的增殖，5 μmol/L抗病毒效果最佳。結合實驗結果3.1，最終選擇抑制PPRV最佳的MPA工作濃度為1 μmol/L，這個濃度對細胞的活性影響相對較小，同時抗病毒的作用顯著。

Mock：不接毒對照組；0 μmol/L：0 μmol/L的MPA處理組；0.1 μmol/L：0.1 μmol/L的MPA處理組；0.5 μmol/L：0.5μmol/L的MPA處理組；1 μmol/L：1 μmol/L的MPA處理組；5 μmol/L：5 μmol/L的MPA處理組

圖3 MPA梯度抑制PPRV的復制

2.3 MPA抑制PPRV增殖的動力學效應

如圖4所示，在最佳終濃度1 μmol/LMPA處理前期0～72 h，病毒的復制得到有效抑制，72 h時對病毒增殖的抑制是對照組(568.1±16.97)倍(P﹤0.001)；96 h時，達到(721.9±24.21)倍(P﹤0.001)。雖然在96 h，對病毒的抑制效果極顯著，但是病毒的增殖量變大。

圖4 不同時間點MPA對PPRV增殖的抑制作用

2.4 鳥苷酸的細胞毒性實驗結果

如圖5所示，鳥苷酸濃度1 μg/mL時細胞活性無顯著差異，鳥苷酸濃度10 μg/mL是細胞活性有顯著差異，鳥苷酸的濃度100 μg/mL時，對細胞活性的影響是極顯著的，所以在研究鳥苷酸對MPA有無拮抗作用實驗中，將此濃度去掉。

圖5 鳥苷酸對Vero細胞活性測定

2.5 不同濃度鳥苷酸對MPA抗PPRV的拮抗作用

如圖6所示，接毒細胞經MPA和鳥苷酸的共同處理后，PPRV的增殖均受到抑制，MPA濃度1 μmol/L時，隨著鳥苷酸濃度的增加，PPRV的增殖量隨之增加，當鳥苷酸濃度為10 μg/mL時差異顯著。單獨添加鳥苷酸的實驗組中，病毒的增殖量有顯著增高。

圖6 鳥苷酸拮抗霉酚酸抗PPRV的作用

3 討 論

PPRV能夠引起小反芻動物的高致病性傳染病，國內外學者對PPRV從其分子生物學、細胞生物學特性、疫病預防以及病毒流行特征進行了大量研究[19-21]。本實驗從抗病毒藥物著手，研究MPA對PPRV的抗病毒作用，以期能找到防控PPR更好的方法。

本研究中，將感染了PPRV的Vero細胞用不同終濃度的MPA[22]分別處理120 h，通過在光學顯微鏡下觀察PPRV病灶的生成和提取總RNA，采用q-PCR高靈敏度檢測方法測定PPRV-H基因的水平，這2種方式確定MPA對PPRV復制的抑制作用。通過顯微鏡觀察，發現隨著MPA的濃度升高，Vero細胞生長狀態越來越好，PPRV感染產生的陽性病灶越來越少，這與q-PCR測定的結果相符合。說明，MPA對PPRV呈劑量依賴性抑制。通過細胞毒性實驗發現，MPA濃度越高，對細胞的毒性越大。設定MPA的最佳濃度在1 μmol/L，測定藥物處理后不同時間點MPA的抗病毒動力學，結果表明24、48和72 h，MPA對PPRV具有顯著地抑制作用；當藥物處理達到96 h后，可能由于藥物的半衰期，病毒的復制明顯增強，但藥物的抗病毒作用依然顯著；隨著培養時間的增加，在120 h時，由于培養基中營養物質的缺乏以及病毒的持續增殖造成細胞發生融合，產生病變，使得細胞的生長狀態發生變化，檢測發現細胞內病毒的復制量逐漸下降，但MPA處理過的病毒增殖量依然比對照組少，這說明MPA可持續抑制PPRV的復制。

本研究通過額外添加鳥苷酸研究了MPA的抗病毒機制，當鳥苷酸與MPA同時作用于感染PPRV的Vero細胞時，鳥苷酸減弱了MPA的抗病毒作用，這一研究結果與MPA抑制IMPDH活性阻礙GTP合成的機制相一致[23]。IMPDH 是嘌呤核苷酸合成的限速酶，在鳥苷酸(GMP)的生物合成中起到了重要作用，MPA是IMPDH非競爭性、可逆性抑制劑，抑制了IMPDH活性，進而影響了GMP、鳥苷二磷酸(GDP)、脫氧鳥苷二磷酸(dGDP)、鳥苷三磷酸(GTP)及脫氧鳥苷三磷酸(dGTP)的合成,而dGTP和GTP對DNA 及RNA 的合成至關重要[24]，進一步證明MPA抑制了細胞內GMP的合成，進而抑制了DNA 及RNA 的合成，抑制了病毒的復制。本研究發現,額外添加鳥苷酸后MPA對PPRV復制的抑制作用被拮抗,其機制在于外加的鳥苷酸通過核苷酸合成的補救通路部分抵消MPA 對鳥苷酸的抑制,進而拮抗了MPA對PPRV 復制的抑制。這進一步證實MPA 在體外對PPRV 復制的抑制作用是通過抑制細胞內鳥苷酸的合成來實現的。

目前針對PPRV，主要是疫苗預防，常規疫苗免疫效果不好，基因工程疫苗價格昂貴，因此亟需對抗病毒藥物進行研究，所以對于MPA的抗PPRV作用，還需在臨床應用上進一步開展動物實驗來確定其作用。

綜上所述，研究結果證明MPA能夠在體外有效地抑制PPRV的增殖。從機制上講，細胞嘌呤核苷酸的消耗對于抗PPRV效應是必不可少的。作為普通藥物，MPA安全性高，并且已經在臨床上用于治療患者幾十年。因此認為，重新利用抗病毒藥物以治療家畜和野生動物中PPRV感染，是一個低成本高效益方案。