河北省部分地區屠宰豬肝臟戊型肝炎抗原的檢測及組織病理學觀察

李睿文,白 云,徐瑞濤,白雪峰

(1.河北農業大學動物醫學院,河北保定071000 ； 2.河北省豐寧滿族自治縣農牧局大閣區域站,河北豐寧068350)

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)感染引起的急性病毒性疾病，主要通過糞-口途徑傳播。戊型肝炎病毒，為肝炎病毒屬肝炎病毒科(Genus Hepevirus in the family Hepeviridae)，并且是本科中唯一成員[1]。世界上首次記載的戊型肝炎，于1955年12月-1956 年1月暴發流行于印度新德里，暴發的原因由于飲用水被糞便污染而引起的，共計發病97 000例，其中29 000例為黃疸型肝炎[2]。迄今為止，戊型肝炎在全世界范圍內均有發病報道，其暴發或流行主要集中在亞洲、非洲的一些發展中國家，特別在一些貧窮落后、衛生習慣較差的地區。

圖1 屠宰豬肝臟HEV陽性染色結果(免疫組化，40×)
Fig.1 HEV positive staining of slaughtered pig liver(Immunohistochemistry, 40×)
白色箭頭：陽性信號 White arrow: Positive signal

圖2 屠宰豬肝臟HEV陰性染色結果(免疫組化，20×)
Fig.2 HEV negative staining of
slaughtered pig liver(Immunohistochemistry, 20×)

圖3 屠宰豬HEV陽性肝臟病理變化(H.E.染色，20×)
Fig.3 Pathological changes of HEV positive liver inslaughtered pigs(H.E. staining, 20 ×)

圖4 屠宰豬HEV陽性肝臟病理變化(Mallory三色染色，40×)
Fig.4 Pathological changes of HEV positive liver inslaughtered pigs(Mallory staining, 40 ×)

在美國、加拿大、英國、法國、荷蘭、德國、意大利及日本、韓國等國家均有戊型肝炎散發病例的報道[3-4]。過去認為主要疫源地為亞非拉等發展中國家，在歐美等發達國家僅有散發病例，主要是由于患者到疫源地旅行感染所致，但有證據表明，在發達國家中也存在沒有到過HE疫源地而自發的病例，而且呈逐年遞增趨勢。

自1997年Meng等發現豬HEV以后，很多研究資料已證實豬是HEV重要的天然動物宿主，而且在HE的傳播過程中起著重要的媒介作用[5]。現已證實HEV可在人、豬間進行種間傳播。很多國家如日本、韓國、中國、蒙古、阿根廷、加拿大、英國、法國、荷蘭、印度尼西亞、意大利、丹麥等均有豬感染HEV的報道，廣泛存在HEV自然感染現象，且呈全球性分布。我國為戊型肝炎高流行區，豬群中HEV抗體陽性率較高，而且不斷有HEV毒株被鑒定[6]。

我國是傳統養豬大國，但養殖規模較小，散養戶居多，因此豬養殖環境不易控制。再者，豬肉是我國漢族大多數人比較喜歡的動物性食品之一。因此，豬的健康狀況如何直接關系到人類的食品安全，同時豬HEV的感染可能通過豬肉制品傳播給人類。因此應加強對豬群中 HEV流行的監測。我國多個地方已報道豬HEV血清學、分子病毒學的調查結果，但河北地區豬戊型肝炎流行狀況資料較少。

1 材料與方法

1.1 豬肝臟的來源 從河北部分地區的屠宰場隨機采集55份屠宰豬肝臟樣品，多聚甲醛-戊二醛混合固定液中固定備用。

1.2 試劑 兔抗人HEV多克隆抗體(一抗)、SP免疫組化染色試劑盒，均購自北京博奧森生物技術有限公司。試劑盒中試劑為3%H2O2去離子水；封閉用正常山羊血清工作液；生物素標記羊抗兔IgG，生物素標記羊抗小鼠IgG；辣根酶標記鏈霉卵白素工作液。顯色劑DAB為美國ZYMED公司產品。

1.3 方法

1.3.1 病理組織切片制作和免疫組織化學染色 按常規石蠟切片制作技術制作連續切片, 分別進行HEV 免疫組織化學染色、蘇木素-伊紅(H.E.)染色及Mallory三色染色法。H.E.染色和Mallory三色染色法按常規方法進行, 免疫組織化學染色方法按試劑操作說明書進行。陰性染色對照不加一抗。

1.3.2 免疫組織化學染色結果的判定 在光學顯微鏡下, HEV 免疫組織化學染色陽性反應信號為棕紅色或棕黃色團塊狀或顆粒狀。

1.3.3 Mallory三色染色法結果判定方法 在光學顯微鏡下，膠原組織和網狀纖維呈藍色，淀粉樣物質呈淡藍色，酸性顆粒呈紅色，紅細胞呈桔紅色。

2 結果

2.1 屠宰豬肝臟中HEV抗原(HEV-Ag)免疫組化檢測 在被檢的55例屠宰豬肝臟中，檢出戊肝病毒抗原陽性有52例，占被檢樣品總數的94.55%；其中陰性3例，占被檢測樣品的5.45%(見表1)。結果表明，河北省部分地區豬HEV感染比較嚴重。

2.2 屠宰豬肝臟中HEV-Ag定位 肝被膜附近的肝組織中，HEV-Ag陽性反應信號常散在分布，而且常常僅見肝細胞核呈明顯的陽性反應，胞漿多呈陰性反應(見中插彩版圖1)。遠離被膜的肝組織，陽性反應信號常成片分布，胞漿多呈陽性反應，而胞核卻較少呈陽性反應。有時，在一個雙核的肝細胞內?？梢娨粋€核呈陽性反應，另一個呈陰性反應。在肝小葉的周邊區，陽性反應信號常散在分布，且常出現于核內間質淋巴細胞呈陰性反應。匯管區的小葉間動脈和靜脈的內皮細胞及小葉間膽管的上皮細胞均呈陽性反應。而HEV-Ag陰性樣品不出現棕紅色或棕黃色團塊狀或顆粒狀物質(見中插彩版圖2)。

表1 屠宰豬肝臟中HEV-Ag免疫組化檢測結果Table 1 Results of immunohistochemical detection of HEV-Ag in liver of slanghtered pigs

2.3 免疫組化陽性屠宰豬肝臟的H.E.染色觀察 光學顯微鏡觀察發現，HEV陽性肝臟組織均有不同程度的病理變化。其病變主要為肝細胞變性萎縮，散在單個核固縮性壞死，淋巴細胞等炎性細胞浸潤、匯管區膽管增生，纖維結締組織增生等變化(見中插彩版圖3)。免疫組化陰性屠宰豬肝臟病理變化不明顯。

2.4 免疫組化陽性屠宰豬肝臟的Mallory三色染色觀察 Mallory三色染色法染色結果表明，在免疫組化陽性的屠宰豬肝臟中，鏡檢發現29.1%的肝組織中纖維結締組織增生(見中插彩版圖4)。而免疫組化陰性屠宰豬肝臟中纖維結締組織增生不明顯。

3 討論

人戊型肝炎是一種對人類危害性較大的疾病。在醫學臨床上，肝臟中HEV抗原的存在，是診斷戊型肝炎的重要依據[7]。免疫組化染色作為一種廣泛應用的技術，在病理診斷上的作用日趨重要。免疫組化染色反應的基本原理是抗原抗體的反應，是通過對針對樣品中相應抗原的抗體上標記某種發色劑或酶類，再通過激發發色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標本中抗原抗體反應的部位產生肉眼可觀察到的顏色，以確定所要檢測的抗原是否存在。通過免疫組織化學染色技術，在光學顯微鏡下即可檢測到所要研究的蛋白類物質的存在與否。免疫組化染色具有陽性率高，敏感性強，背景清晰，試劑商品化，使用方便等特點，也是診斷戊型肝炎常用的方法之一。本試驗應用免疫組織化學方法檢測屠宰豬肝臟中戊型肝炎病毒抗原，結果發現，55例屠宰豬肝臟中HEV抗原陽性率為94.55%；其中陰性3例，占被檢測樣品的5.45%；弱陽性20例，占被檢測樣品的36.36%；陽性27例，占被檢測樣品的49.09%；強陽性5例，占被檢測樣品的9.09%。結果表明，在河北部分地區日常生活中食用的屠宰豬群中HEV的感染是非常普遍的，而且感染率也很高。此外，本試驗結果還表明，HEV免疫組化陽性屠宰豬肝臟中均表現出較為明顯的肝炎病變。主要表現為肝實質損傷病變，即肝細胞變性、壞死，同時伴有炎性細胞浸潤；間質出現了結締組織不同程度增生和炎性細胞浸潤。在HEV免疫組化陽性肝臟中，肝臟病變主要為淋巴細胞浸潤、肝細胞變性、壞死、匯管區膽管增生、纖維結締組織增生。從本試驗結果中HEV抗原陽性屠宰豬肝臟的組織病理學變化情況來看，其病理變化與人戊型肝炎的病理變化相似[8]。反映了當前河北部分地區屠宰豬戊型肝炎感染方面存在著比較嚴重的問題。本試驗結果表明，目前河北部分地區屠宰豬肝臟存在有戊型肝炎的感染痕跡，并且病變情況與戊型肝炎病毒感染相似，這個結果與以往報道相符合。目前可以證實河北部分地區屠宰豬的肝臟中存在與戊型肝炎病毒相關的抗原。

本試驗中檢測的免疫組化陽性屠宰豬肝臟樣品中，29.1%的肝臟組織學都有不同程度的纖維化，表明戊型肝炎病毒可引起豬慢性肝炎，呈現明顯纖維化，為進一步研究戊型肝炎致病機理提供了流行病學資料。