嗜水氣單胞菌感染大鯢的病理組織學(xué)觀察

林衍榮,吳 青,黎學(xué)練,沙 莎

(1.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,重慶榮昌402460 ; 2.重慶開州水產(chǎn)技術(shù)推廣站,重慶開州405400)

中國(guó)大鯢(Andriasdavidianus)又稱娃娃魚，屬兩棲類(Amphibian)、有尾目(Urodela)、隱鰓鯢科(Crypt obrachidae)、大鯢屬(Andrias)，是我國(guó)特有的水陸兩棲類動(dòng)物[1]。在養(yǎng)殖大鯢的細(xì)菌性疾病中，氣單胞菌屬中的嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[2]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[3]等是常見的致病菌，能引起皮膚潰瘍及敗血癥等。在養(yǎng)殖大鯢感染嗜水氣單胞菌的研究中有分離鑒定的報(bào)道，但少見系統(tǒng)的病理組織學(xué)研究。將嗜水氣單胞菌感染大鯢并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，可以促進(jìn)嗜水氣單胞菌對(duì)大鯢致病機(jī)理的研究和提供研究依據(jù)。

圖3 BPA暴露7 d各組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)變化(H.E.染色，100×)
Fig.3 Structural changes of uterine tissue of rats in each group after 7 days of BPA exposure(H.E.staining,100×)
A～D:劑量分別為0、20、60、180 mg/(kg·bw)
A～D: Uterus structure of 0、20、60、180 mg/(kg·bw) group separately

圖4 BPA暴露7 d各組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)變化(H.E.染色，40×)
Fig.4 Structural changes of ovarian tissues in each group of rats after 7 days of BPA exposure(H.E.stain,40×)
A～D:劑量分別為0、20、60、180 mg/(kg·bw)
A～D: Uterus structure of 0、20、60、180 mg/(kg·bw) group separately

1 材料與方法

1.1 樣本 病理樣本：將由病死大鯢中分離得到的嗜水氣單胞菌接種于正常大鯢。采取接種后死亡的大鯢臟器，取部分組織用于分離鑒定，其余的保存在10%中性福爾馬林溶液中。(從采取的組織內(nèi)鑒定出嗜水氣單胞菌，證明大鯢被感染。)

正常樣本：養(yǎng)殖大鯢的新鮮臟器(購(gòu)自重慶某大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)，用10%中性福爾馬林固定)。

1.2 方法 制備再改良的Harris蘇木素染液[4]及沉淀酸化伊紅-Y染液[5]。將固定好的組織制作石蠟切片，并將完成H.E.染色的正常組織切片和病理組織切片在尼康E100顯微鏡下觀察并攝影。

2 結(jié)果

正常大鯢組織的H.E.染色結(jié)果見中插彩版圖1～12。嗜水氣單胞菌感染大鯢的各組織的H.E.染色結(jié)果如下所述。

心：鏡檢心包膜脫落；部分心肌纖維腫脹、斷裂；心肌細(xì)胞空泡變性，細(xì)胞核溶解、破裂；心臟內(nèi)可見大量充血、淤血(見中插彩版圖13)。

肝：鏡檢肝臟內(nèi)存在大量壞死灶，壞死灶中的細(xì)胞破裂、溶解，在壞死灶周圍可見大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝索排列紊亂，血竇間充滿大量紅細(xì)胞；肝細(xì)胞腫大，發(fā)生空泡變性、淀粉樣變性(見中插彩版圖14)；小葉間靜脈及毛細(xì)血管內(nèi)淤血(見中插彩版圖15)；小葉間膽管細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞核被擠于一側(cè)，部分小葉間膽管破裂。

脾：鏡檢可見少量壞死灶，壞死灶內(nèi)細(xì)胞溶解破裂；紅髓、白髓大量減少；網(wǎng)狀細(xì)胞胞核溶解、碎裂(見中插彩版圖16)。

肺：鏡檢肺泡腔內(nèi)充滿數(shù)量不等的紅細(xì)胞，部分囊腔內(nèi)可見炎性細(xì)胞；肺動(dòng)脈充血(見中插彩版圖17)；平滑肌層內(nèi)可見少量紅染蛋白性物質(zhì)；部分肌纖維空泡變性，有的細(xì)胞核溶解。

腎：鏡檢腎動(dòng)脈充血；腎間質(zhì)出血，有大量紅細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小管上皮細(xì)胞胞核溶解、破裂(見中插彩版圖18)，管腔內(nèi)可見脫落的上皮細(xì)胞、紅細(xì)胞及均質(zhì)紅染的蛋白樣物質(zhì)；腎小球球囊囊間隙增寬；周圍的結(jié)締組織疏松水腫。

胰：鏡檢可見胰腺細(xì)胞溶解、破裂、壞死；部分區(qū)域有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；存在散在的出血點(diǎn)；血管內(nèi)有蛋白纖維性物質(zhì)(見中插彩版圖19)。

腸：鏡檢小腸黏膜上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增加，紋狀緣消失，肌層與漿膜層間隙增大(見中插彩版圖20)；黏膜層出血；黏膜層可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見中插彩版圖21)。

胃：鏡檢胃黏膜脫落；黏膜上層輕微出血；外縱肌層肌細(xì)胞腫脹斷裂，顏色深染；肌肉層與漿膜層間隙增大(見中插彩版圖22)；部分區(qū)域漿膜脫落。

皮膚：鏡檢表皮脫落，皮膚結(jié)構(gòu)不完整(見中插彩版圖23、圖24)，腺泡腔內(nèi)充滿大量紅細(xì)胞，毛細(xì)血管內(nèi)可見淤血。

3 討論

3.1 嗜水氣單胞菌對(duì)大鯢臟器組織損傷機(jī)理 嗜水氣單胞菌是氣單胞菌屬的模式種，革蘭陰性，為短小桿菌，有鞭毛，無(wú)莢膜，不形成芽孢。生長(zhǎng)溫度為4～41 ℃，最適溫度為25～30 ℃。生長(zhǎng)pH值為5.0～9.0，最適pH值為7.2～7.4，可引起魚類的腸炎，蛙的紅腿病，也可造成大鯢的腹水病、腐皮病[2,7-9]。因嗜水氣單胞菌能通過(guò)許多不同的調(diào)節(jié)機(jī)制改變基因表達(dá)和適應(yīng)生存環(huán)境，現(xiàn)被認(rèn)為是病原菌而非機(jī)會(huì)性致病菌[10]。病菌目前已知的毒力因子有：粘附素、脂多糖、胞外產(chǎn)物等，其中粘附素是細(xì)菌感染動(dòng)物的關(guān)鍵[11]。

在自然條件下，嗜水氣單胞菌可通過(guò)粘附素粘附于中國(guó)大鯢皮膚、腸道的細(xì)胞表面，通過(guò)一定的機(jī)制、途徑侵入動(dòng)物機(jī)體，定植于皮膚及腸道內(nèi)的細(xì)胞[12-13]。在細(xì)菌定植期間，菌體的膜外蛋白與宿主細(xì)胞膜受體的糖殘基發(fā)生反應(yīng)，從而聚集在宿主細(xì)胞上；細(xì)菌的脂多糖可使菌體改變代謝，以適應(yīng)溫度、pH值、滲透壓等，同時(shí)作為細(xì)菌內(nèi)毒素的主要物質(zhì)又可造成組織內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目變化和彌散性血管內(nèi)凝血，抑制層粘連蛋白和嵌有脂質(zhì)的層粘連蛋白受體的結(jié)合，使黏膜、漿膜受損；其膜外蛋白、S層蛋白、胞外蛋白酶等可保護(hù)菌體免受吞噬及抗體、補(bǔ)體的作用[7,10-14]。細(xì)菌定植后大量繁殖，奪取宿主的營(yíng)養(yǎng)，使大鯢機(jī)體的抵抗力進(jìn)一步下降，腸道中的菌體通過(guò)肝門靜脈感染肝臟、胰臟等器官[6]，進(jìn)而通過(guò)體循環(huán)感染全身各組織臟器。菌體在不同的組織細(xì)胞內(nèi)定植、增殖后產(chǎn)生外毒素。大多數(shù)的外毒素又通過(guò)蛋白酶降解發(fā)揮活性，其中：溶血素具有溶血性與細(xì)胞毒性，能引發(fā)敗血癥與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，亦可抗吞噬；氣溶素具有溶血性、腸毒性和細(xì)胞毒性，其成熟的蛋白可破壞細(xì)胞膜的滲透性使細(xì)胞死亡；尿素酶對(duì)菌體具有保護(hù)作用，還可產(chǎn)生氨削弱黏液的屏障功能，造成細(xì)胞變性[7,11-14]。在各種毒力因子的作用下，對(duì)大鯢機(jī)體造成損傷。

與自然條件不同，本試驗(yàn)的大鯢病理樣本為腹腔注射接種嗜水氣單胞菌的感染病例。細(xì)菌直接粘附于內(nèi)臟組織，定植于各器官的細(xì)胞上，進(jìn)行增殖，產(chǎn)生毒素。各種毒素因子相互協(xié)作共同作用于大鯢機(jī)體，損傷組織臟器的黏膜、漿膜，影響白細(xì)胞數(shù)量變化，使組織細(xì)胞發(fā)生變性，血管內(nèi)充血、淤血。從病理切片的觀察結(jié)果中亦可證實(shí)：胃、腸的黏膜受損；皮膚表皮脫落；腎小管上皮細(xì)胞脫落、碎裂；心臟、肝臟及腎臟的細(xì)胞發(fā)生變性，可見細(xì)胞溶解、碎裂，肝內(nèi)存在大量的壞死灶；肝、腸、胰有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，脾臟白髓減少；多數(shù)組織器官內(nèi)有不同程度的充血、出血及淤血。其中對(duì)肝臟、腎臟、脾臟造成的病理?yè)p傷最為嚴(yán)重，影響大鯢的物質(zhì)能量代謝，破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，降低大鯢的免疫能力，最終使多器官、系統(tǒng)功能衰竭，造成死亡。

3.2 嗜水氣單胞菌感染與大鯢養(yǎng)殖的關(guān)系 我國(guó)大鯢人工繁育成功已有40年，在大鯢的病害方面的研究也有多年的經(jīng)驗(yàn)累積。嗜水氣單胞菌感染中國(guó)大鯢是細(xì)菌、環(huán)境及宿主間復(fù)雜的分子作用的結(jié)果[8]。在自然環(huán)境中生長(zhǎng)的大鯢對(duì)疾病有較強(qiáng)的抵抗力，是因?yàn)椋阂吧篥F種群密度較小；食物多樣；環(huán)境水質(zhì)環(huán)境良好，溶解氧氣充足；病源少且不易傳播[15]。相比在人工養(yǎng)殖的環(huán)境中，雖然大鯢的食物來(lái)源得到保證，但是食物種類單一；隨著集約化程度的不斷提高，大鯢打斗致使皮膚破潰的機(jī)率增大；且在一定季節(jié)，養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的水質(zhì)環(huán)境與嗜水氣單胞菌的最適生長(zhǎng)溫度、pH值相近，使得養(yǎng)殖大鯢更易染病。因此，保持大鯢養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境良好，定期消毒檢疫，合理控制大鯢養(yǎng)殖密度，實(shí)行分級(jí)飼養(yǎng)技術(shù)，可減少大鯢疾病的發(fā)生[16]。科學(xué)的飼養(yǎng)與綜合管理對(duì)疫病的預(yù)防、發(fā)生及控制起著至關(guān)重要的作用。