現(xiàn)代生物技術(shù)在木薯育種中的應(yīng)用

朱涵鈺

摘要 ? ?木薯是世界上重要糧食作物和經(jīng)濟作物，其遺傳改良日益受重視。現(xiàn)代生物技術(shù)在培育優(yōu)良木薯品種方面具有時間短、效率高等優(yōu)勢。本文介紹了近年來誘變育種、分子標(biāo)記輔助選擇育種、轉(zhuǎn)基因工程等現(xiàn)代生物技術(shù)在木薯育種中的研究與利用概況，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)加快獲得具有產(chǎn)量高、抗逆性強、品質(zhì)高等優(yōu)良特性的木薯新品種提供參考。

關(guān)鍵詞 ? ?木薯;現(xiàn)代生物技術(shù);育種

中圖分類號 ? ?S533;S33 ? ? ? ?文獻標(biāo)識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2020）13-0039-04 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

Abstract ? ?Cassava （Manihot esculenta Crantz） is an important food and economic crop in the world， and its genetic improvement has been paid more and more attentionco. Modern biotechnology has advantages of short time and high efficiency in cultivating excellent cassava varieties. This article introduced the recent research and utilization of modern biotechnology in cassava breeding such as mutation breeding， molecular marker-assisted selection breeding ?and transgenic breeding， in order to ?provide a reference for accelerating the acquisition of new cassava varieties with excellent characteristics such as high production， strong resistance， and high quality by modern biotechnology.

Key words ? ?cassava; modern biotechnology; breeding

木薯（Manihot esculenta Crantz）是大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬（Manihot）植物，與紅薯、馬鈴薯合稱世界三大薯類，是該屬植物中唯一的栽培種。木薯起源于南美洲的亞馬遜河流域，距今已有4 000年的人類利用史，目前廣泛種植于非洲、亞洲和美洲等110余個國家或地區(qū)。19世紀(jì)20年代木薯由華人從馬來西亞傳入中國廣東，再傳播到海南、云南及廣西等地。

木薯用途十分廣泛，作為熱帶地區(qū)第三大糧食作物、全球第六大糧食作物，被稱為“淀粉之王”[1]，是世界近6億人的口糧。同時，木薯是最廉價的淀粉來源，可加工成酒精等各種工業(yè)產(chǎn)品，解決石油資源短缺等問題。我國每年木薯種植面積約60萬hm2，但遠遠不能滿足國內(nèi)對淀粉產(chǎn)品的需求。因此，保障木薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)這個目標(biāo)一直促使育種家去培育種質(zhì)更加優(yōu)良的木薯品種。

常見的木薯品種培育有2種方式，包括常規(guī)雜交育種和以現(xiàn)代生物技術(shù)為基礎(chǔ)的分子育種。木薯的常規(guī)育種由于木薯基因高度雜合、遺傳背景復(fù)雜、自交不親和、花粉育性低、后代性狀分離嚴(yán)重以及優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源匱乏等問題，導(dǎo)致常規(guī)育種具有時間長、選擇效率低等特點。近年來，植物生物技術(shù)迅速推廣，在改良植物品質(zhì)方面的應(yīng)用逐漸成熟。現(xiàn)代生物技術(shù)在培育木薯優(yōu)良品種方面具有以下幾個方面的優(yōu)勢：一是木薯是以無性繁殖為主的作物，轉(zhuǎn)入基因不存在分離現(xiàn)象，可短時間內(nèi)得到優(yōu)良的抗性品種;二是木薯一般秋季開花，花期較長，成熟時即可收獲，不存在花粉漂移導(dǎo)致的外源基因擴散等問題;三是木薯在我國主要作為工業(yè)原料，食用比例很小，基本無需擔(dān)心轉(zhuǎn)基因木薯的安全性。

本文重點介紹近年來的幾種主要生物技術(shù)，包括誘變育種、分子標(biāo)記輔助選擇育種、轉(zhuǎn)基因育種等在甘薯育種中的發(fā)展與應(yīng)用，以期促進木薯分子育種工作的開展。

1 ? ?誘變育種

木薯是一種無性繁殖作物，其育種過程中變異來源主要來自于自然變異與人工誘變產(chǎn)生的變異，但自然條件下外界環(huán)境的變化和遺傳結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性產(chǎn)生的突變頻率較低。因此，利用γ射線、60Co處理等輻射誘變的方式和秋水仙素等化學(xué)誘變成為木薯種質(zhì)創(chuàng)新研究的有效技術(shù)手段。另外，近年來利用TILLING等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為無性繁殖作物細胞工程育種提供了新的動力[2]。

γ射線誘變育種可創(chuàng)造高頻率的變異，獲得具有穩(wěn)定遺傳特性的突變體，可作為木薯選育種的有效途徑。陸柳英等[3]利用輻射劑量率為1 Gy/min的γ射線對胚狀體子葉、體細胞胚和帶單芽莖段進行不同劑量的輻射處理，結(jié)果顯示，輻射劑量在10～20 Gy之間對胚狀體的子葉和體細胞胚更有效，而木薯單芽莖段γ射線輻射的劑量需低于10 Gy。Asare等[4]對IITA來源的幾個材料的種莖利用γ射線進行輻射誘變，在M1V3和M1V4代進行材料鑒定篩選，獲得高產(chǎn)和高抗病性的突變株系，同時薯塊加工性也得到顯著提高。Joseph等[5]利用輻射強度為50、100、200、300 Gy的γ射線對木薯PRC60a的不同時期體細胞胚、子葉和嫩葉進行處理，結(jié)果顯示，球形體細胞胚可獲得一系列在植株表型及塊根特性方面差異表現(xiàn)的突變株系，相對子葉和嫩葉可作為最適合的外植體;其中S15在直鏈淀粉含量和淀粉含量相比野生型分別下降30%和50%。Sanchez等[6]對木薯種子進行γ射線誘變，經(jīng)過M1與M2 2代鑒定篩選獲得一批淀粉顆粒小、直鏈淀粉含量高等性狀的突變株系，在木薯淀粉降解和食品工業(yè)上有重要經(jīng)濟應(yīng)用價值。因此，γ射線誘變育種可創(chuàng)造具有穩(wěn)定遺傳性的突變體，是有效的木薯育種途徑之一。

化學(xué)誘變育種是利用甲基磺酸乙酯（EMS）、秋水仙素等化學(xué)誘變劑處理植物材料，使之產(chǎn)生形態(tài)特征的變異，然后通過多世代對這些變異進行鑒定、選擇和培育，最終育成新品種。化學(xué)誘變是一種迅速發(fā)展的育種途徑，具有成本低、誘變作用專一性強等特點。陸柳英等[7]利用EMS對木薯品種華南124和華南8號的組培苗帶芽莖段進行誘變，初步建立了以帶芽莖段為外植體EMS誘變技術(shù)方法。胡小元等[8]用EMS和NaN3處理木薯組織的頂端2個莖節(jié)，相比γ射線和快中子處理等物理輻射產(chǎn)生相近的效果，其所產(chǎn)生的損傷相對較易恢復(fù)。另外，秋水仙素也是一種誘導(dǎo)效率較好的處理方式。Nassar等[9]通過秋水仙素誘導(dǎo)染色體加倍、遠緣雜交等技術(shù)，獲得UnB201、UnB310等各類木薯多倍體材料，且在產(chǎn)量、品質(zhì)等方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。GR4X系類則是廣西壯族自治區(qū)熱帶作物研究所通過秋水仙素進行木薯多倍體誘變育種選育出來的優(yōu)良木薯品系。

2 ? ?分子標(biāo)記輔助選擇育種

分子標(biāo)記技術(shù)自誕生以來，目前成為現(xiàn)代作物育種中不可缺少的工具，在玉米、大豆等農(nóng)作物上均有成功應(yīng)用的案例。基因發(fā)現(xiàn)和定位、分子育種、后代性狀表現(xiàn)預(yù)測和基因組選擇等分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合，可提高育種效率，縮短育種周期。木薯的產(chǎn)量、品質(zhì)等大多數(shù)農(nóng)藝性狀以及與抗病性相關(guān)的性狀均表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳，且各性狀表現(xiàn)一定的相關(guān)性。因此，分子標(biāo)記輔助（MAS）選擇對木薯育種進程的加快具有重大意義。

2.1 ? ?構(gòu)建甘薯分子遺傳圖譜

由于木薯的基因高度雜合，遺傳背景較復(fù)雜，對木薯基因組的研究相對滯后，分子標(biāo)記的數(shù)量和種類及遺傳圖譜的構(gòu)建相對匱乏。1997年Ceballos等[10]利用RFLP標(biāo)記、RAPD標(biāo)記構(gòu)建了第1張木薯分子遺傳圖譜，成為木薯重要性狀的遺傳分析與研究的重要參照工具。之后，國內(nèi)外學(xué)者先后對木薯分子遺傳圖譜的構(gòu)建進行了探索與研究。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，SSR標(biāo)記克服RFLP標(biāo)記標(biāo)記密度低及RAPD無法區(qū)分雜合子與純合子的缺點，成為木薯分子遺傳圖譜的構(gòu)建中的主要標(biāo)記。Okogbenin等[11]于2006年利用木薯自交系F2代群體，構(gòu)建了一張包含100個SSR標(biāo)記的遺傳圖譜。Kunkeaw等[12]利用木薯的F2代群體構(gòu)建了一張包含510個EST-SSR/SSR混合標(biāo)記的遺傳圖譜。Chen等[13]利用木薯的雜交F1代群體，構(gòu)建了包含200個AFLPs、EST-SSRs和SSRs混合標(biāo)記的遺傳圖譜，總長度達到1 645.1 cM，滿足定位需求。Ekogbenin等構(gòu)建的木薯分子遺傳圖譜就是基于開發(fā)的472個SSR標(biāo)記和鑒定的100個SSR標(biāo)記。Fregene等[14]對木薯品種CM2177—2和TMSI30572雜交產(chǎn)生的150個F1代株系開發(fā)了172個SSR標(biāo)記用以構(gòu)建木薯遺傳連鎖圖譜。近幾年，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為高密度遺傳圖的構(gòu)建提供了契機，單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（SNP）分子標(biāo)記又成為研究熱點。Rabbi等[15]對180個木薯分離群體利用GBS（genotyping-by-sequencing）技術(shù)進行測序，構(gòu)建了包含6 756個SNP標(biāo)記的木薯第1張高密度遺傳圖譜。Xia等[16]利用木薯分離群體的85個株系，構(gòu)建了一張含有2 331個SNP標(biāo)記、537個INDEL標(biāo)記和164個甲基化位點的遺傳圖譜。Pootakham等[17]對16個木薯品種進行轉(zhuǎn)錄組測序并進行分析，最終得到了一張包含2 110個EST-SNP標(biāo)記的遺傳圖譜。Ramu等[18]對241個木薯群體進行全基因組重測序，構(gòu)建了包含了2 600萬個SNPs和190萬個indels的木薯單倍型圖譜（HapMapII），可作為木薯分子標(biāo)記輔助選擇育種的重要遺傳圖譜。

2.2 ? ?木薯種質(zhì)遺傳多樣性分析

目前，全球收集的木薯種質(zhì)逾8 500份，主要來自非洲、東南亞、南美洲等地區(qū)。雖然木薯引種到我國距今已有200年的種植歷史，但我國的木薯材料收集、保存和利用相對較晚，但也取得了一定的成績。目前，在海南儋州建立了屬于中國的木薯種質(zhì)資源圃，共收集逾500份木薯材料，進行品種的表型、產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性等性狀的考察評價，建立每個材料的檔案，為木薯育種奠定基礎(chǔ)。隨著分子標(biāo)記的發(fā)展，木薯材料親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析得以進行，從而為木薯種質(zhì)的保存和利用提供更加準(zhǔn)確的方法。Fregene等[19]利用SSR標(biāo)記對來源秘魯、巴西和哥倫比亞等國的283個木薯地方品種進行多樣性的分析評價，結(jié)果顯示，不同區(qū)域來源的木薯種質(zhì)具有復(fù)雜的遺傳多樣性，其中來自哥倫比亞和巴西的木薯材料基因多樣性水平最高，具有豐富的基因變異。韋祖生等[20]等利用EST-SSR分子標(biāo)記引物對76份木薯材料（包括37份國內(nèi)種質(zhì)和39份引進種質(zhì)）進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，39份引進種質(zhì)區(qū)別于國內(nèi)種質(zhì)遺傳類型，豐富了我國的木薯種質(zhì)資源。王 ?明等[21]利用44對SSR引物對195份國內(nèi)（外）品種（系）進行遺傳多樣性分析，可將供試材料分為7個亞群，各品種（系）的遺傳相似系數(shù)（GS）分布在0.57～0.99之間。張圣奎等[22]利用25 989個SNP和indels標(biāo)記對158 份不同來源（包括中國、南美洲等地）的木薯群體進行遺傳多樣性評估，發(fā)現(xiàn)群體結(jié)構(gòu)可劃分為3個亞群，遺傳多樣性指數(shù)為1.21×10-4。主成分分析和進化樹分析表明，木薯的亞群主要受其起源地影響，而與種質(zhì)采集地沒有明顯的分化關(guān)系。另外，通過對遺傳多樣性的整理和總結(jié)，構(gòu)建木薯種質(zhì)資源的指紋圖譜，為木薯品種的管理和推廣奠定基礎(chǔ)。如齊蘭等對18份高淀粉木薯材料DNA指紋圖譜的構(gòu)建，為木薯品種的真實度鑒定、品種保護提供依據(jù)。

2.3 ? ?木薯基因定位和DNA分子標(biāo)記輔助選擇育種

木薯塊根產(chǎn)量、抗病性、品質(zhì)等重要農(nóng)藝性狀均屬于微效多基因控制的數(shù)量性狀。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建木薯的連鎖圖譜。通過QTL定位和關(guān)聯(lián)分析，對重要農(nóng)藝性狀進行基因定位克隆，進而改良木薯品種抗病等特性，成為木薯育種研究的重要方向。Akano等[23]和Lokko等[24]采用集團分析法（BSA）分別對木薯不同的F1分離群體進行抗花葉病性狀的QTL定位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性標(biāo)記SSRY28可解釋的群體變異超過50%。Pootakham等[25]利用自己構(gòu)建的高密度遺傳圖譜，定位了2個木薯淀粉糊化特性QTL，其中一個和前人的報道一致。Wang等[26]利用木薯自然群體對一些抗旱性相關(guān)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，得到53個相應(yīng)的QTL位點，平均可以解釋8.6%的表型變異。Welsch等[27]對木薯薯肉顏色的研究中發(fā)現(xiàn)，VA的含量高低與黃色薯肉有關(guān)，由八氫番茄紅素基因PSY中的一個SNP位點變異決定，而且該SNP位點可以開發(fā)為CAPS（cleaved amplified polymorphic sequences）標(biāo)記，用于木薯品種的選育。CIAT和尼日利亞國際熱帶農(nóng)業(yè)研究所（IITA）專家利用傳統(tǒng)育種和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，成功培育出抗花葉病的木薯品種CR41-10并釋放到市場中。吉家敏等[28]結(jié)合主產(chǎn)區(qū)木薯遺傳群體的8個復(fù)雜重要性狀，進行木薯耐寒、產(chǎn)量與品質(zhì)相關(guān)QTLepi和QTL定位，發(fā)掘候選基因WRKYre CT-QTLTFs、WRKY31和WRKY9等，為木薯的耐寒性品種改良提供技術(shù)支持。

3 ? ?轉(zhuǎn)基因育種

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是作物育種方法的一次革命。經(jīng)過120多年的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因如今已被廣泛應(yīng)用農(nóng)業(yè)作物育種中，用于提高作物產(chǎn)量和改良作物品質(zhì)，給人類帶來巨大的經(jīng)濟和社會效益。相對于其他作物，木薯的轉(zhuǎn)基因育種研究起步較晚。

3.1 ? ?品質(zhì)改良轉(zhuǎn)基因工程

除種子外，木薯其他組織中均含有低毒的氰苷物質(zhì)，其組成為亞麻苦苷和百脈根苷。氰苷物質(zhì)在胃酸和特殊酶的作用下會被分解成對人體有毒的氫氰酸，中毒后會發(fā)生呼吸困難、心跳加快、嘔吐、昏迷等不良癥狀。因此，減少甚至清除木薯塊根中氰化物含量，提高食用安全性與加工品質(zhì)，是現(xiàn)代木薯育種研究中亟待解決的問題之一。Siritunga等[29]以CaMV35S啟動子驅(qū)動羥基裂解酶（HNL）在木薯品種Co12215中過表達，塊根CG總量不變，但塊根中HNL則提高達800%～1 300%，采后脫毒能力大幅提高。Abhar等利用馬鈴薯糖蛋白驅(qū)動子和啟動子改良木薯品種TMS60444塊根蛋白含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因木薯葉和根莖氰化物含量均降低近55%，為研究改良木薯氰化物含量提供了新的思路[30]。

此外，提高木薯淀粉含量和改變直鏈/支鏈淀粉比例也是研究熱點。木薯塊根鮮樣淀粉含量一般為24%～32%，干樣淀粉含量為73%～83%，且木薯淀粉中有支鏈和直鏈淀粉2種形式，其中直鏈淀粉約占17%、支鏈淀粉占83%。Ihemere等[31]以木薯品種TMS71173為轉(zhuǎn)化材料，利用馬鈴薯塊莖特異啟動子patatin驅(qū)動大腸桿菌glgC（G336D）進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果顯示，木薯塊根中淀粉含量增加近3倍，同時AGPase活性提高70%。

3.2 ? ?抗病抗除草劑基因工程

木薯常見病蟲害包括病毒類的木薯褐條病（CBSD）、細菌性枯萎病（CBB）、木薯花葉病（CMD）、角斑病等。Thresh等[32]調(diào)研顯示，在非洲褐條病導(dǎo)致的木薯減產(chǎn)幅度可達35%，局部地區(qū)甚至高達70%。Yadav等[33]在木薯品種TMS60444以CBSUV外殼蛋白基因全長為靶目標(biāo)，通過RNA干擾技術(shù)，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)抑制靶基因在木薯中的表達，獲得了完全抵抗木薯褐條烏干達病毒（CBSUV）的抗性木薯。Pita等[34]將ACMV復(fù)制酶基因AC1導(dǎo)入木薯品種TMS60444，獲得了ACMV抗性木薯，同時對其他常見病毒也具有一定抵抗能力。Ntui等[35]利用木薯品種KU50構(gòu)建RNA干擾載體轉(zhuǎn)化載體，獲得抗斯里蘭卡木薯花葉病毒（SLCMV）木薯。另外，參考草甘膦和草丁膦在其玉米、大轉(zhuǎn)基因方面的應(yīng)用，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)賦予木瓜抗除草劑特性，可有效除去田間雜草，實現(xiàn)高產(chǎn)低耗的效應(yīng)。Sarria等[36]首次嘗試以木薯品種MPerl83為載體，將草丁膦抗性基因bar導(dǎo)入其中，獲得的3個轉(zhuǎn)化株系，均對草丁膦產(chǎn)生一定的抗性作用。

3.3 ? ?抗逆基因工程

木薯的育種目標(biāo)始終是選育高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、耐寒、適應(yīng)性廣、抗逆性強的優(yōu)良品種。木薯對冷害敏感，不耐低溫和霜凍，因而木薯品種的耐寒性強弱直接關(guān)系到木薯產(chǎn)量的高低。陳松筆等[37]以木薯品種TMS60444為載體，將APX和Cu/ZnSOD共表達載體轉(zhuǎn)化其中，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化株系的耐寒性得到提高，APX酶和SOD酶活性較對照均不同程度提高。李 ?筠等[38]在木薯中同時導(dǎo)入Cu/ZnSOD和APX，結(jié)果顯示，在干旱脅迫條件下具有較強的活性氧清除能力，葉片含水量和耐寒性得到提高。王 ?燕等[39]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)向木薯西選03中轉(zhuǎn)入抗逆性基因，從而增強木薯的抗逆性，減輕自然災(zāi)害的危害程度。王 ?穎等[40]將蔗糖果糖基轉(zhuǎn)移酶1-SST基因?qū)肽臼砥贩NSC6中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陽性單株的抗逆性大大增加。

4 ? ?展望

現(xiàn)代生物技術(shù)已經(jīng)在木薯育種中得到迅速發(fā)展。相對于傳統(tǒng)的資源引進的育種方法，誘變育種具有操作性強、突變率高等特點，但變異不定向，需大田田間表型鑒定公司鑒定。而分子標(biāo)記輔助選擇育種是實施定向設(shè)計育種，具有周期短、效率高等特點，但需要依據(jù)已知基因和表型性狀優(yōu)良的抗性資源。轉(zhuǎn)基因育種具有快速定向培育新種質(zhì)資源的優(yōu)勢，具有抗蟲、抗除草劑性狀，適合綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展，但同時需嚴(yán)格遵守國家轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)監(jiān)管和限制釋放[41]。為保障國家糧食安全，滿足國內(nèi)對木薯淀粉的需求，在較短時間內(nèi)培育出淀粉含量高、抗逆性強、食用安全的木薯新品種，可在常規(guī)育種技術(shù)的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代生育育種技術(shù)，建立高效的木薯綜合育種技術(shù)方法。

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