花椰菜黑腐病苗期抗性鑒定方法研究

姚玉榮 霍建飛 郝永娟 賁海燕 王萬立

摘要?為建立快速、高效的花椰菜黑腐病苗期抗性鑒定技術(shù)，以黑腐病病原?Xanthomonas campestris?pv.?campestiss為?菌源，高感黑腐病的花椰菜品種Y1-2為試驗材料，研究了接種菌液濃度、苗齡、接種方法以及發(fā)病溫度等因素對抗病性鑒定的影響，建立了優(yōu)化的花椰菜黑腐病人工接種方法。結(jié)果表明， 抗病性接種適宜條件為接種菌液濃度為1×108CFU/mL，接種時期為4～5葉期，噴霧法接種，發(fā)病溫度28 ℃。該方法鑒定結(jié)果能夠客觀反映花椰菜品種的抗病性。

關(guān)鍵詞?花椰菜; 黑腐病;抗性鑒定

中圖分類號?S436.3?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）14-0137-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.038

Abstract?In order to develop a rapid and efficient technique for evaluation of resistance to black rot by using artificial inoculation with the pathogenic?Xanthomonas campestris?pv.?campestiss?and the cauliflower variety Y1-2， the effects of inoculation concentration， seedling age， inoculation method and temperature were studied. The optimizing artificial inoculation methods for black rot identification were set up. The results showed that the key procedure was praying inoculum liquor of 1×108 CFU/mL on seedling with 4-5 true leaves stage keeping at 28 ℃. The identification results of the established assessment system can objectively and effectively reflect the resistance of cauliflower.

Key words?Brassica oleracea?var.?botrytis;?Black rot;Resistance identification

十字花科蔬菜黑腐病是由野油菜黃單孢菌野油菜致病變種?Xanthomonas campestris?pv.?campestiss?（Pam.） Down引起的一種世界性重要病害[1-2]。20世紀(jì)50年代末在華北地區(qū)發(fā)生[3]，80年代在全國各地普遍流行，極大威脅著十字花科蔬菜的生產(chǎn)，嚴(yán)重時減產(chǎn)70%[4]。種子帶菌是黑腐病的主要侵染源和重要傳播方式，其帶菌率達(dá)0.03%就能造成生產(chǎn)上黑腐病暴發(fā)[5]。生產(chǎn)上黑腐病的防治方法主要包括化學(xué)藥劑防治，農(nóng)事操作如輪作、清楚病殘體等，但最經(jīng)濟(jì)、有效的防治措施為選育抗病品種。

苗期人工接種是篩選抗病品種和種質(zhì)資源創(chuàng)新的前提條件。不同作物抗病性鑒定方法不同。研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜、甘藍(lán)黑腐病鑒定時接種濃度為1×108CFU/mL時利于發(fā)病[6];大白菜黑腐病抗病鑒定接種物最佳濃度為3.0×108CFU/mL[7]。不同作物接種最佳苗齡不同，蘿卜接種最佳苗齡為5～6葉期[8]，甘藍(lán)最佳苗齡為4～6葉期[9]。近年來，隨著我國菜田復(fù)種指數(shù)提高，花椰菜黑腐病的發(fā)病程度和發(fā)病率呈上升趨勢，篩選花椰菜黑腐病抗源十分必要，但關(guān)于花椰菜黑腐病抗病性鑒定方法尚未見系統(tǒng)報道。

筆者以天津地區(qū)花椰菜主產(chǎn)區(qū)致病力強的黑腐病病菌?Xanthomonas campestris?pv.?campestiss為?菌源，以天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所高感黑腐病品種Y1-2為試驗材料，研究了接種濃度、苗齡、接種方法以及發(fā)病溫度對抗病性鑒定的影響，建立了優(yōu)化的花椰菜黑腐病苗期接種鑒定方法。

1?材料與方法

1.1?試驗材料?供試菌株：黑腐病菌野油菜黃單孢菌野油菜致病變種（?Xanthomonas campestris?pv.?campestiss，?簡稱Xcc）由天津市植物保護(hù)研究所蔬菜病害實驗室分離保存。

供試品種：花椰菜高代純合自交系Y1-2（高感）、EC-247（抗病）、EC-455（抗病）、EC-464（抗病），由天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司蔬菜研究所提供。

將供試花椰菜種子在50 ℃熱水中處理10 min，播種于育苗穴盤內(nèi)。育苗基質(zhì)為蛭石∶草炭∶土壤=1∶1∶2，滅菌后備用。

1.2?試驗方法

1.2.1?抗病鑒定方法。

抗病鑒定方法參考《中國主要蔬菜抗病育種》[10]，并加以改進(jìn)。

病情指數(shù) =（發(fā)病葉數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）×100

病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0 級.無病癥; 1級.葉片有黑色枯死點，無擴(kuò)展; 3 級.病斑向外擴(kuò)展，占葉面積 5%以下;5級.病斑向外擴(kuò)展，占葉面積5%～25%;7 級.病斑向外擴(kuò)展，占葉面積25%～50%;9 級.病斑向外擴(kuò)展，占葉面積50%以上。

抗病性標(biāo)準(zhǔn)：免疫（I）.病情指數(shù)為0;高抗（HR）.0<病情指數(shù)≤11.11;抗病（R）.11.11<病情指數(shù)≤33.33;耐病（T）.33.33<病情指數(shù)≤55.55;感病（S）.55.55<病情指數(shù)≤67.77;高感（HS）.67.77<病情指數(shù)≤100。

1.2.2?不同接種菌液濃度。將培養(yǎng)24 h的菌液濃度調(diào)節(jié)至1×106、1×108、×1010CFU/mL 3個濃度。

1.2.3?不同接種寄主苗齡。接種苗齡為2～3葉期、4～5葉期、6～7葉期、8～9葉期，接種菌液濃度為1×108 CFU/mL。

1.2.4?不同接種方法。

花椰菜黑腐病主要通過傷口和水孔侵入，參照李永鎬等[11]的方法并略有改進(jìn)，采用剪葉、噴霧法進(jìn)行比較。剪葉法：用滅菌的醫(yī)用剪刀沾取接種物在完全展開的葉片尖端 垂直于主脈的方向剪掉 0.5～1.0 cm ，每剪1次沾取1次菌液;噴霧法：用小型噴霧器將接種物噴灑到植株上。2種接種方法在接種前后保濕24 h。

1.2.5?不同發(fā)病溫度。采用“1.2.1”確定的最佳菌液濃度，采用噴霧法接種于4～5葉期的花椰菜幼苗上，溫度設(shè)置為24、26、28、30 ℃。

1.3?花椰菜苗期抗病鑒定技術(shù)的驗證

將建立的人工接種鑒定技術(shù)對已知抗性的5個花椰菜品種進(jìn)行苗期抗性鑒定，設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)10株，對等量的無菌水作空白對照。

1.4?數(shù)據(jù)分析?試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft office Excel 2010分析，統(tǒng)計分析采用SPSS 21軟件，采用Duncans新復(fù)極差法（?P?<0.05）進(jìn)行顯著性分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同接種菌液濃度對接種效果的影響

不同接種菌液濃度下，花椰菜幼苗黑腐病發(fā)病率病情指數(shù)隨著菌液濃度增加而增大，各處理間差異顯著（表1）。其中接種菌液濃度為1×108CFU/mL時，發(fā)病率為82.14%，病情指數(shù)為69.21，能夠真實反映出花椰菜Y1-2本身抗性，菌液濃度為1×106CFU/mL 時，發(fā)病較輕，品種表現(xiàn)為抗性，不能真實反映植株本身的抗性;菌液濃度為1×1010CFU/mL時，發(fā)病率達(dá)93.33%，病情指數(shù)為83.78，發(fā)病嚴(yán)重，不能體現(xiàn)品種的真實抗性。菌液接種濃度1×108CFU/mL為最佳接種濃度。

2.2?不同接種寄主苗齡對接種效果的影響?4個苗齡試驗中2～3葉期接種時，由于幼苗較小，接種后發(fā)病面積較大，發(fā)病嚴(yán)重，平均發(fā)病率達(dá)96.34%，病情指數(shù)為85.53（表2）。苗齡為4～5葉期發(fā)病率為75.00%，病情指數(shù)為68.51，適合用于苗期接種。苗齡6～7葉及8～9葉，幼苗較大，抗性增強，病情指數(shù)為50.91和31.35，抗性水平表現(xiàn)為耐病和抗性，不能真實反映品種抗性。因此4～5葉期的苗齡適合花椰菜苗期抗黑腐病接種鑒定。

2.3?不同接種方法對接種效果的影響

剪葉法接種較噴霧法接種發(fā)病快，剪葉法接種2 d開始發(fā)病，而噴霧法第4天開始發(fā)病。接種10 d后調(diào)查，剪葉法和噴霧法接種的發(fā)病率為100%和81.61%，病指指數(shù)為85.37和67.93（表3），2種方法均可用于花椰菜苗期接種鑒定，但由于噴霧法操作快捷，因此選擇噴霧法進(jìn)行花椰菜苗期黑腐病接種鑒定。

2.4?不同發(fā)病溫度對接種效果的影響

由表4可知，處理溫度為24 ℃時，花椰菜Y1-2表現(xiàn)為抗性，溫度為26 ℃時，表現(xiàn)為感病，這2個溫度均不能表現(xiàn)出品種的真正抗性，不能用于苗期抗病性鑒定。溫度為28和30 ℃時均表現(xiàn)為高感，但30 ℃時，植株幾乎全部死亡，無法計算病情指數(shù)。適宜花椰菜苗期黑腐病抗病性鑒定的溫度為28 ℃。

2.5?花椰菜苗期抗性鑒定技術(shù)的驗證

根據(jù)上述結(jié)果對已知抗性的5份品種進(jìn)行接種鑒定。結(jié)果顯示，5份品種抗性表現(xiàn)與已知抗性相符，該試驗建立的花椰菜苗期抗性鑒定技術(shù)能夠客觀反映試驗材料的抗性水平（表5）。

3?結(jié)論與討論

該試驗結(jié)果表明，在一定范圍隨著接種菌物濃度的提高，黑腐病發(fā)病率和病情指數(shù)增加，最佳接種濃度為1×108CFU/mL，這與李永鎬等[11]的甘藍(lán)黑腐病苗期接種濃度結(jié)果一致。苗齡比較結(jié)果顯示，4～5葉期適宜苗期接種，苗齡小發(fā)病重，苗齡大植株本身抗性增強，均無法體現(xiàn)品種真實抗性。噴霧接種法是國內(nèi)外最普遍采用的接種方法，Bandyopadhyay等[12]認(rèn)為黑腐病作用位點為水孔。噴霧接種后病原菌在水孔處擴(kuò)展蔓延，能夠全面反映寄主的抗病性，而且該方法具有簡單、快捷、高效等特點，適合花椰菜黑腐病的抗性鑒定。龔靜等[13]采用噴霧方法對38個甘藍(lán)品種進(jìn)行抗病性鑒定，結(jié)果顯示該方法能夠準(zhǔn)確區(qū)分抗感材料。研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，花椰菜對黑腐病的抗性降低，與甘藍(lán)及大白菜對黑腐病的研究結(jié)果相一致[14-15]。

該研究建立和優(yōu)化了花椰菜黑腐病苗期抗病性鑒定方法，即噴霧法接種，菌液濃度1×108CFU/mL，苗齡4～5葉期，發(fā)病溫度28 ℃，接種7 d后調(diào)查發(fā)病情況。該方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，能夠客觀反映花椰菜品種的抗性。植物對病害的抗病性表現(xiàn)受多方面因素的影響，全面準(zhǔn)確鑒定不同品種抗黑腐病的表現(xiàn)，仍需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]WILLIAMS P H，STAUB T，SUTTON J C.Inheritance of resistance in cabbage to black rot[J]. Phytopathology， 1972， 62：247-252.