霍山石斛薄層鑒別研究

戴亞峰 王詩文 王淵 縱瑞葉 潘躍 黃躍華 尚亮亮

摘要?[目的]]研究霍山石斛薄層鑒別方法，為霍山石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。[方法]采用薄層色譜法對霍山石斛、鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、河南石斛進(jìn)行定性鑒別。[結(jié)果]霍山石斛能明顯地區(qū)別于鐵皮石斛、細(xì)莖石斛及河南石斛。[結(jié)論]已確定的薄層鑒別方法操作簡單、可靠、專屬性強(qiáng)，可以用于霍山石斛的薄層鑒別。

關(guān)鍵詞?霍山石斛;鐵皮石斛;細(xì)莖石斛;河南石斛;方法學(xué);薄層鑒別

中圖分類號?R284?文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）14-0168-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.14.047

Abstract?[Objective]To establish a method to indentify?Dendrobium huoshanense?by TLC，and to provide basis for establishment of quality standard of?D.huoshanense?. [Method]TLC was used for the qualitative identification of?D.huoshanense， Dendrobiun officinale?Kimura et Migo，?Dendrobium moniliforme?（L.） Sw. and?Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao. [Result]D.huoshanense?was significantly different from?D.officinale， D.moniliforme?and?D.henanense.?[Conclusion]The established method is simple， reliable and specific. It can be used in the qualitative identification of?D.huoshanense.

Key words?Dendrobium huoshanense;Dendrobiun officinale?Kimura et Migo;?Dendrobium moniliforme?（L.） Sw.;?Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao;Methodology;TLC

霍山石斛是蘭科石斛屬植物，主要產(chǎn)于大別山區(qū)的安徽省霍山縣，具有益胃生津、滋陰清熱、養(yǎng)肝明目、潤肺止渴等功效[1]，是歷代中醫(yī)名家推崇之養(yǎng)生佳品，享有“中華仙草之最” 的美譽(yù)[2]。霍山石斛生長環(huán)境要求高，以及長期以來無限制的采挖，野生霍山石斛的資源已近枯竭，物種瀕臨滅絕[3]。隨著市場上霍山石斛需求量的日漸增大，其栽培品種正在逐漸地推向市場。而因?yàn)榛羯绞纳L周期長，培植成本高，生產(chǎn)產(chǎn)量供不應(yīng)求，它的偽品產(chǎn)量日益增大，充斥著石斛市場，嚴(yán)重?cái)_亂了正常的市場秩序。近年來，對于霍山石斛的研究主要集中于組培育苗、大棚栽培方向[4];而關(guān)于霍山石斛化學(xué)成分的研究卻鮮見報(bào)道，有待進(jìn)一步加強(qiáng)。迄今為止，有關(guān)霍山石斛化學(xué)成分的研究主要集中于霍山石斛多糖和生物堿方面[5-10]。霍山石斛的薄層鑒別方面所見報(bào)道很少，由魏剛等[11]出版的《中華仙草 霍山石斛》（2015年10月出版）中，對霍山石斛薄層鑒別有所體現(xiàn)，但其所載的薄層鑒別方法不能有效地區(qū)分霍山石斛與鐵皮石斛，未體現(xiàn)出霍山石斛的特征斑點(diǎn)。筆者對霍山石斛薄層鑒別進(jìn)行進(jìn)一步的研究，并對研究出的鑒別方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)，以期為霍山石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試材。選取5批霍山石斛（表1），各批次霍山石斛經(jīng)鑒定為霍山石斛?Dendrobium huoshanense?C.Z. Tang et S.J. Cheng。鐵皮石斛?（Dendrobiun officinale?Kimura et Migo），批號121501-201201，ID：XAD3-95SK，來源于中國食品藥品檢定研究院。

細(xì)莖石斛?[Dendrobium moniliforme?（L.） Sw.]，批號20150406，由九仙尊霍山石斛股份有限公司栽培技術(shù)中心提供。河南石斛?（Dendrobium henanense?J.L.Lu et L. X. Gao），批號20150406，由九仙尊霍山石斛股份有限公司栽培技術(shù)中心提供。

1.1.2?試劑。薄層色譜用聚酰胺薄膜，分別購買于浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠出品、武漢鑫思銳科技有限公司;試驗(yàn)所用試劑均為分析純，購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;試驗(yàn)用水為雙重蒸餾水。

1.1.3?儀器。ZF-2型三用紫外分析儀（上海安亭電子儀器廠）;EX224ZH型電子天平（美國奧豪斯）;JP-020超聲波清洗機(jī)（深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?樣品溶液的制備。

取霍山石斛粉末（過2號篩）1 g，加無水甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用石油醚（60～90 ℃）洗滌2次，每次20 mL，棄去石油醚液，水液用乙酸乙酯洗滌2次，每次20 mL，棄去洗液，用水飽和正丁醇振搖提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，沸水浴蒸干，殘?jiān)訜o水甲醇1 mL使溶解作為霍山石斛樣品溶液。另取鐵皮石斛對照藥材、細(xì)莖石斛、河南石斛同法制成鐵皮石斛對照溶液、細(xì)莖石斛樣品溶液、河南石斛樣品溶液。

1.2.2?方法耐用性考察。

1.2.2.1?不同固定相考察方法。

將20150126批霍山石斛樣品溶液，按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取3～5 μL，分別點(diǎn)樣于3種聚酰胺薄膜上（表2），以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）為展開劑，展開，取出，105 ℃烘干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃烘約3 min，置365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.2.2?不同展開劑考察方法。

將20150126批霍山石斛樣品溶液，按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取3～5 μL，分別點(diǎn)樣于同一批號的聚酰胺薄膜上，分別在不同的展開劑（表3）中展開，取出，105 ℃烘干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃烘約3 min，置365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.2.3?不同展開環(huán)境考察方法。

將20150126批霍山石斛樣品溶液，按照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取3～5 μL，分別點(diǎn)樣于同一批號的聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）為展開劑，設(shè)置不同的室內(nèi)環(huán)境（表4），在不同的室內(nèi)環(huán)境中展開，取出，105 ℃烘干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃烘約3 min，置365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.3?方法專屬性考察。按照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取20150126批霍山石斛樣品溶液、鐵皮石斛對照溶液、細(xì)莖石斛樣品溶液、河南石斛樣品溶液各3～5 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）為展開劑，展開，取出，105 ℃烘干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃烘約3 min，置365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.4?霍山石斛薄層鑒別。按照薄層色譜法試驗(yàn)，分別吸取20150126、20150228、20150402、20150530、20150625共5批霍山石斛樣品溶液、鐵皮石斛樣品溶液、細(xì)莖石斛樣品溶液各3～5 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙醇-丁酮-乙酰丙酮-水（20∶20∶5∶85）為展開劑，在溫度低于20 ℃的環(huán)境下展開，取出，105 ℃烘干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105 ℃烘約3 min，置365 nm紫外光燈下檢視。

2?結(jié)果與分析

2.1?方法耐用性考察

2.1.1?不同固定相考察。

由圖1可知，采用不同廠家的聚酰胺薄膜及同一廠家不同批號的聚酰胺薄膜為固定相，霍山石斛薄層鑒別色譜圖無明顯差異，固定相1中各斑點(diǎn)分離效果較固定相2、固定相3好。

2.1.2?不同展開劑考察。

由圖2可知，對展開劑進(jìn)行微小的變動，霍山石斛薄層鑒別色譜圖存在較明顯的差異，霍山石斛薄層鑒別展開劑要求嚴(yán)格按照已確定的配比進(jìn)行精密配制。

2.1.3?不同展開環(huán)境考察。

由圖3可知，對霍山石斛薄層鑒別展開時(shí)室內(nèi)環(huán)境進(jìn)行考察，在低溫的環(huán)境下（圖3a），各斑點(diǎn)分離較好，在空調(diào)25 ℃制熱、相對濕度70%的條件下（圖3d），霍山石斛各斑點(diǎn)基本無法正常分離。因此，霍山石斛薄層鑒別，在色譜展開的過程中，建議控制室溫在20 ℃以下，確保各斑點(diǎn)顯色清晰可辨。

2.2?方法專屬性考察?由霍山石斛專屬性考察（圖4）可知，霍山石斛薄層色譜圖能明顯區(qū)分于其親緣性很近的鐵皮石斛、河南石斛、細(xì)莖石斛，即已確定的霍山石斛薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，可用于霍山石斛的鑒別。

2.3?霍山石斛薄層鑒別?由5批霍山石斛薄層色譜圖（圖5）可知，不同批次間霍山石斛存在細(xì)微的差異，但不影響霍山石斛的整體鑒別;霍山石斛能明顯地區(qū)分于鐵皮石斛和細(xì)莖石斛。霍山石斛薄層鑒別方法簡單、可操作性強(qiáng)。

3?結(jié)論與討論

霍山石斛具有很高的商業(yè)價(jià)值[12]，因此市場上假冒偽劣產(chǎn)品現(xiàn)象嚴(yán)重。近年來對霍山石斛的鑒別方法很多，各有利弊。傳統(tǒng)霍山石斛的鑒別方法均為外觀性狀及顯微鑒別，難以區(qū)分真?zhèn)?王暉等[13]對霍山石斛及其常見混偽品進(jìn)行了DNA條形碼分析，但方法操作復(fù)雜且成本高昂。

許莉等[14]采用薄層色譜鑒別方法對細(xì)莖石斛、金釵石斛等20種石斛進(jìn)行了考察，其未對霍山石斛進(jìn)行研究;由魏剛等[11]出版的《中華仙草 霍山石斛》中雖利用薄層色譜法對霍山石斛、細(xì)莖石斛、鐵皮石斛進(jìn)行鑒別，但無法區(qū)分霍山石斛與鐵皮石斛。這2個(gè)文獻(xiàn)涉及的鑒別方法與該研究均不相同。從上述薄層鑒別試驗(yàn)結(jié)果中斑點(diǎn)的有無、斑點(diǎn)的大小、斑點(diǎn)顏色深淺上可以看出，霍山石斛與細(xì)莖石斛、鐵皮石斛、河南石斛中所含化學(xué)成分及含量有較大差異，霍山石斛相比細(xì)莖石斛、鐵皮石斛和河南石斛有一明顯特征斑點(diǎn)。該研究結(jié)果表明霍山石斛中含有多種黃酮類成分，且與鐵皮石斛、細(xì)莖石斛、河南石斛有一定的差別。到目前為止，暫未確定從霍山石斛中分離出來的特征斑點(diǎn)屬于哪種黃酮類成分，需要進(jìn)一步的研究。

通過對霍山石斛薄層鑒別方法進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)可知，霍山石斛薄層鑒別方法操作簡單、可靠、專屬性強(qiáng)，可用于霍山石斛的薄層鑒別，為霍山石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供理論依據(jù)。

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