miR-373-3p通過(guò)靶向Rab22a調(diào)節(jié)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移

楊 熹, 丁永斌, 宋冬梅,葛 軍, 顏雪方

結(jié)腸癌是臨床常見(jiàn)的癌癥類型，是癌癥導(dǎo)致死亡的主要原因之一，癌基因的過(guò)度激活與抑癌基因的失活是導(dǎo)致結(jié)腸癌發(fā)生的主要因素[1]。目前對(duì)結(jié)腸癌的治療方案主要包括手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療以及靶向治療[2]。手術(shù)治療是目前結(jié)腸癌治療的一線方案，然而由于腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，能夠取得的效果有限[3]。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA分子，在細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與生存等各個(gè)方面均發(fā)揮著重要的作用，miRNA可靶向結(jié)合于目的mRNA，導(dǎo)致目的mRNA翻譯抑制或者降解，miRNA在癌組織中的異常表達(dá)與癌癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，因此，基于miRNA的理論，目前已發(fā)展出了一系列全新的診斷和治療方案[4]。miR-373-3p是一種人類胚胎干細(xì)胞特異性的miRNA，研究表明，其在癌細(xì)胞中扮演著截然不同的角色。有證據(jù)指出miR-373-3p在一些癌癥中發(fā)揮著致癌基因的角色，然而，同樣有文獻(xiàn)報(bào)道了miR-373-3p對(duì)一些癌癥的抑制作用[5]。該研究在前人研究的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，并通過(guò)miR-373-3p mimic和Rab22a過(guò)表達(dá)細(xì)胞株，探究了在結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-373-3p與Rab蛋白22a(Rab22a)的相互作用關(guān)系及其調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素、TRizol提取液、RIPA裂解液、BCA試劑盒、CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；miR-373-3p mimic、陰性對(duì)照mimic(mimic NC)、Rab22a重組慢病毒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；所用引物由上海生工生物公司合成；Primescript RT Reagent kit和SYBR PremixEX Taq II試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司；GAPDH、Rab22a、Ki67、上皮性鈣黏附蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)性鈣黏附蛋白(N-cadherin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)NCM460人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和SW480、SW620、HCT116和LOVO人結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，使用加入了10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)條件5%CO2、37 ℃。

1.3 細(xì)胞分組及處理將SW480細(xì)胞分為不經(jīng)任何處理的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞組(SW480組)、陰性對(duì)照組(mimic NC組)、miR-373-3p mimic組、pLV-Rab22a組、pLV-Rab22a+miR-373-3p組， mimic NC轉(zhuǎn)染mimic NC組細(xì)胞，miR-373-3p mimic轉(zhuǎn)染miR-373-3p組細(xì)胞，Rab22a重組慢病毒轉(zhuǎn)染pLV-Rab22a組、miR-373-3p mimic和Rab22a重組慢病毒共轉(zhuǎn)染pLV-Rab22a+miR-373-3p組，miRNA轉(zhuǎn)染的操作按照l(shuí)ipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 結(jié)腸癌樣本獲取27例結(jié)腸癌組織及配對(duì)正常結(jié)腸組織樣本取自南京醫(yī)科大學(xué)附屬江蘇盛澤醫(yī)院2016年12月～2019年1月結(jié)腸癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，年齡37～77(61.33±12.27)歲，術(shù)前未經(jīng)過(guò)任何放化療治療處理，樣本取材后使用液氮速凍，-80 ℃冰箱中保存，本研究已獲該院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者或家屬同意。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)量約為5×104個(gè)，細(xì)胞鋪滿板中70%時(shí)，每孔加入10 μl 1×108TU/ml重組慢病毒轉(zhuǎn)染24 h，換完全培養(yǎng)液5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 RT-PCR檢測(cè)使用TRIzol溶液，抽提各組樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)SYBR PremixEX Taq Ⅱ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)mRNA或miRNA水平，PCR按95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

1.7 熒光素酶實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miR-373-3p和Rab22a的靶向結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)位點(diǎn)序列構(gòu)建pGL3 luciferase promoter野生型(wt)和突變型(mut)載體，載體分別與miR-373-3p mimic和mimic NC共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)熒光素酶活性。

1.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖將各組細(xì)胞按1.3項(xiàng)的方法處理后，常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)，每1 d使用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖倍數(shù)，連續(xù)測(cè)定3 d。測(cè)定時(shí)將細(xì)胞接種于96孔板，每孔10 μl的CCK8試劑處理4 h，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm的吸光度值。

1.9 劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞在板內(nèi)鋪滿80%后，使用中等槍頭垂直于水平面進(jìn)行劃線，使用PBS緩沖液清洗，在常規(guī)條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，通過(guò)顯微鏡觀察劃痕愈合率。

1.10 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞侵襲在Transwell小室中加入50 μl基質(zhì)膠，37 ℃凝固3 h，上室和下室分別加入無(wú)血清培養(yǎng)液和完全培養(yǎng)液，細(xì)胞接種于上室，常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h，擦洗掉未能通過(guò)膜的細(xì)胞，殘余細(xì)胞通過(guò)多聚甲醛進(jìn)行固定，結(jié)晶紫染色后顯微鏡觀察。

1.11 Western blot檢測(cè)使用RIPA溶液，抽提各組樣品總蛋白，BCA試劑盒定量，根據(jù)蛋白濃度，在點(diǎn)樣孔中按每孔30 μg上樣量加樣，10% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入適量一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗后加入適量二抗繼續(xù)孵育2 h，ECL顯色液顯影。

2 結(jié)果

2.1 miR-373-3p在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)對(duì)27例臨床樣本進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，如圖1所示，與配對(duì)正常結(jié)腸組織比較，結(jié)腸癌組織中miR-373-3p表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.58,P<0.01)；對(duì)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460比較，SW480、SW620、HCT116和LOVO細(xì)胞株中miR-373-3p表達(dá)均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.44，P<0.01)。

2.2 miR-373-3p抑制Rab22a mRNA轉(zhuǎn)錄miR-373-3p轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-373-3p和Rab22a相對(duì)表達(dá)水平，如圖2所示，與SW480組比較，mimic NC組中miR-373-3p表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-373-3p mimic組中miR-373-3p表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=358.42，P<0.01)，表明miR-373-3p成功轉(zhuǎn)染了SW480細(xì)胞株；同時(shí)，與SW480組比較，mimic NC組Rab22a轉(zhuǎn)錄水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-373-3p mimic組Rab22a轉(zhuǎn)錄水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=92.33，P<0.01)。

2.3 miR-373-3p靶向作用于Rab22a生物信息學(xué)分析了miR-373-3p與Rab22a的相互作用位點(diǎn)，檢測(cè)熒光素酶活性，如圖3所示，與Rab22a WT+mimic NC組比較，Rab22a WT+miR-373-3p mimic組熒光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.33，P<0.01)；同時(shí)，Rab22a MUT+miR-373-3p mimic組與Rab22a MUT+mimic NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 RT-PCR檢測(cè)miR-373-3p在結(jié)腸癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)

圖2 RT-PCR檢測(cè)SW480細(xì)胞株中miR-373-3p

圖3 熒光素報(bào)告基因檢測(cè)miR-373-3p與Rab22a靶向作用關(guān)系

2.4 miR-373-3p抑制細(xì)胞增殖通過(guò)CCK-8檢測(cè)了各組細(xì)胞在3 d內(nèi)的細(xì)胞增殖水平，如圖4所示，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細(xì)胞增殖水平降低(F=178.42，P<0.01)，pLV-Rab22a組細(xì)胞增殖水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.48，P<0.01)；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組SW480細(xì)胞增殖水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=49.21，P<0.01)。

圖4 CCK-8檢測(cè)SW480細(xì)胞株細(xì)胞增殖水平

2.5 miR-373-3p抑制細(xì)胞遷移通過(guò)劃痕愈合法檢測(cè)了各組細(xì)胞的遷移能力，如圖5所示，SW480、miR-373-3p mimic、pLV-Rab22a、pLV-Rab22a+miR-373-3p各組細(xì)胞劃痕愈合率分別為(67.3±8.0%)、(26.8±5.1%)、(89.3±9.3%)、(51.0±6.5%)，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細(xì)胞劃痕愈合率降低(F=78.85，P<0.01)，pLV-Rab22a組細(xì)胞劃痕愈合率升高(F=31.43，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組細(xì)胞劃痕愈合率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=62.61，P<0.01)。

圖5 劃痕愈合法檢測(cè)SW480細(xì)胞株遷移能力 ×100

2.6 miR-373-3p抑制細(xì)胞侵襲通過(guò)Transwell法檢測(cè)了各組細(xì)胞的侵襲能力，如圖6所示，SW480、miR-373-3p mimic、pLV-Rab22a、pLV-Rab22a+miR-373-3p各組細(xì)胞侵襲數(shù)目分別為(147±11)、(56±7)、(241±22)、(134±15)，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組細(xì)胞侵襲數(shù)目降低(F=89.30，P<0.01)，pLV-Rab22a組細(xì)胞侵襲數(shù)目升高(F=55.28，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組細(xì)胞侵襲數(shù)目降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=75.35，P<0.01)。

2.7 miR-373-3p抑制Rab22a蛋白表達(dá)并調(diào)控增殖和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)通過(guò)Western blot檢測(cè)了各組中Rab22a和增殖轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，如圖7所示，與SW480組比較，miR-373-3p mimic組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高(F=102.03，P<0.01)，同時(shí)pLV-Rab22a組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低(F=233.43，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與pLV-Rab22a組比較，pLV-Rab22a+miR-373-3p組Rab22a、Ki67、N-cadherin蛋白表達(dá)降低，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=172.35，P<0.01)。

圖6 Transwell檢測(cè)SW480細(xì)胞株侵襲能力 ×200

3 討論

Rab家族屬于Ras小GTP酶超家族，在細(xì)胞內(nèi)與蛋白囊泡運(yùn)輸有著重要的關(guān)系，已有超過(guò)60種已知的Rab蛋白定位于不同的膜結(jié)合區(qū)域。這些GTP酶與GDP結(jié)合時(shí)處于失活狀態(tài)，與GTP結(jié)合時(shí)處于激活狀態(tài)，活化的Rab蛋白可與特定胞膜結(jié)合并促進(jìn)效應(yīng)因子復(fù)合物的形成，在膜識(shí)別、融合、膜脂成分改變、細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)等各個(gè)方面起著重要作用[6]。Rab22a是Rab家族的成員之一，在內(nèi)體囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Rab22a過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致內(nèi)體形態(tài)改變，并妨礙內(nèi)體向高爾基體的分子交流[7]。研究[8]表明，Rab22a在多種人類癌癥疾病中表達(dá)上調(diào)，在粘著斑形成、腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是一種致癌基因。Rab22a在結(jié)腸癌中也起著促進(jìn)腫瘤發(fā)生的作用，Yin et al[9]報(bào)道了miR-204-5p可通過(guò)下調(diào)Rab22a的表達(dá)抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞的增殖與侵襲，并增加其對(duì)化療藥物的敏感性。miR-373-3p是一種在人類胚胎干細(xì)胞中特異性高表達(dá)的miRNA[10]，在不同腫瘤組織中miR-373-3p呈現(xiàn)異常表達(dá)，根據(jù)腫瘤細(xì)胞類型的不同，分別發(fā)揮著促瘤和抑瘤的作用，表明miR-373-3p在腫瘤中的調(diào)控作用具有細(xì)胞特異性[11]。在結(jié)腸癌中，文獻(xiàn)報(bào)道了miR-373-3p具有腫瘤抑制作用，Tanaka et al[12]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中miR-373-3p發(fā)生異常甲基化，導(dǎo)致表達(dá)量下調(diào)，同時(shí)促癌基因Rab22a mRNA表達(dá)水平升高；同時(shí)Zhang et al[13]研究表明在卵巢癌中miR-373-3p通過(guò)靶向下調(diào)Rab22a表達(dá)抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，推測(cè)在結(jié)腸癌中miR-373-3p也可通過(guò)靶向下調(diào)Rab22a的表達(dá)抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。為了證實(shí)這一推測(cè)，本研究首先檢測(cè)了miR-373-3p在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平，結(jié)果表明在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞中miR-373-3p表達(dá)水平降低。進(jìn)一步通過(guò)miR-373-3p mimic轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞株，結(jié)果顯示miR-373-3p抑制了Rab22a的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，證實(shí)了miR-373-3p對(duì)Rab22a存在調(diào)控作用。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了miR-373-3p與Rab22a的靶向作用關(guān)系。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-373-3p在SW480細(xì)胞內(nèi)可靶向抑制Rab22a的表達(dá)。

圖7 Western blot檢測(cè)Rab22a、Ki67、N-cadherin、E-cadherin蛋白表達(dá)

細(xì)胞增殖不受限制、易發(fā)生轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞主要特征，Rab22a具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[9]。為了進(jìn)一步探究miR-373-3p靶向作用于Rab22a對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，本研究對(duì)SW480細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等方面進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明miR-373-3p抑制了SW480細(xì)胞的增殖，Rab22a過(guò)表達(dá)可減輕miR-373-3p對(duì)增殖的抑制作用；同時(shí)，本研究顯示miR-373-3p抑制了SW480細(xì)胞的遷移和侵襲，Rab22a過(guò)表達(dá)可減輕miR-373-3p對(duì)遷移和侵襲的抑制作用。此外，miR-373-3p降低了Ki67和N-cadherin的蛋白表達(dá)，提高了E-cadherin的表達(dá)，Rab22a可逆轉(zhuǎn)miR-373-3p的調(diào)控作用。Ki67是常見(jiàn)的細(xì)胞增殖標(biāo)志物，其水平變化可反映出細(xì)胞增殖的情況[14]；N-cadherin是一種間葉細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin是一種上皮細(xì)胞標(biāo)志物，E-cadherin下調(diào)以及N-cadherin上調(diào)標(biāo)志著細(xì)胞從上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，細(xì)胞的遷移和侵襲能力提升[15-16]。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-373-3p可通過(guò)下調(diào)Rab22a表達(dá)抑制SW480細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

綜上，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，miR-373-3p可靶向作用于Rab22a，降低Rab22a的基因和蛋白表達(dá)水平，抑制Ki67和N-cadherin的表達(dá)，提高E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究從體外水平SW480研究了miR-373-3p對(duì)Rab22a的靶向關(guān)系及其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用，今后考慮構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，進(jìn)一步探討miR-373-3p和Rab22a在裸鼠體內(nèi)的調(diào)控作用及機(jī)制。